Pacientes com Intolerância Reações de Substituição Total do Joelho: Avaliação Combinada de Alergia Diagnóstico, Periprosthetic Histologia e Peri-implante de Citocinas de Padrão de Expressão

Resumo

realizou-se uma abordagem combinada para identificar suspeita de alergia à artroplastia do joelho (TKR): teste de patch (PT), de linfócitos transformação de teste (LTT), histopatologia (classificação geral; Linfócitos T E B, macrófagos e neutrófilos) e análise mediadora inflamatória periprotética semiquantitativa baseada em PCR em tempo Real (IFNy, TNFa, IL1-β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 e TGFß). Analisamos 25 pacientes com TKR com complicações ainda inexplicáveis, como dor, derrame e amplitude de movimento reduzida. Eles consistiram em 20 pacientes com sensibilização metal comprovada (11 com reações PT; 9 com apenas reatividade LTT). Amostras de controle foram de 5 pacientes complicados com TKR sem sensibilização de metal, 12 pacientes com OA antes da artroplastia e 8 pacientes com PT sem artroplastia. Infiltrados linfocíticos foram observados e a resposta tecidual fibrótica (membrana tipo IV) foi mais frequente nos pacientes sensíveis ao metal, por exemplo, em 81% dos pacientes com PT positivo. Este último também tinha marcado expressão IFNy periprotética. 8/9 pacientes com cirurgia de revisão usando implantes revestidos com Ti/oxínio relataram alívio dos sintomas. Nossos resultados demonstram que combinar diagnósticos de alergia com histopatologia e avaliação de citocinas periprotéticas poderia nos permitir projetar melhores estratégias diagnósticas.

1. Introdução

a substituição do quadril e do joelho são procedimentos cirúrgicos muito bem-sucedidos para restaurar a qualidade de vida em pacientes com osteoartrite e, consequentemente, as taxas de implantação estão aumentando constantemente . No entanto, em uma parte substancial desses pacientes, a falha do implante leva à revisão do implante. Uma revisão recente lista uma taxa de revisão total de substituição do joelho (TKR) de 9,5% na Alemanha e de 8,4% nos EUA para o ano de 2011 . Dentro do espectro de condições que levam a reações adversas de falha de TKR podem ser encontradas, mas o papel da alergia ainda é uma questão controversa. A alergia cutânea ao metal é frequente na população em geral, por exemplo, aproximadamente 13% ao níquel (Ni), 2% ao cobalto (Co) e 1% ao cromo (Cr) . O desgaste ou a corrosão levam à exposição peri-implante e metal sistêmico (particularmente Ni, Cr ou Co) de pacientes com artroplastia e, correspondentemente , a prevalência de sensibilidade ao metal em pacientes com implante falhado é relatada como aumentada . No que diz respeito à substituição total do quadril, o afrouxamento asséptico foi atribuído principalmente ao desgaste associado macrófago dominado corpo estranho resposta como mecanismo subjacente . Ao longo da última década, a atenção voltou-se para o papel da hipersensibilidade na inflamação peri-implante. Em particular, na artroplastia metal-metal, um subgrupo de pacientes foi descrito mostrando inflamação linfocítica bastante peri-implante como potencial elicitor de falha do implante . As alterações histológicas descritas incluem infiltração difusa, perivascular ou linfática (linfóide) de linfócitos e poucos macrófagos, vênulas endoteliais altas e, em parte, necrose tecidual . A alergia ao Metal como fator contribuinte foi sugerida pela ligação observada entre inflamação linfocítica peri-implante, reatividade do teste de remendo aos metais e resposta aprimorada do teste de transformação linfocitária (LTT) aos metais em uma série desses pacientes . No entanto, ainda há discussão controversa, em que medida a alergia ao metal contribui para as reações adversas do “termo guarda-chuva” na artroplastia do quadril . Na verdade, pacientes alérgicos a metais podem tolerar os respectivos metais que contêm implante . No que diz respeito ao TKR , também existem relatos de alergia cutânea a Metais encontrados em associação com complicações, mas ainda não é investigado se essa alergia a metais é responsável pela reação biológica. Como estamos vendo pacientes com suspeita de reações de intolerância ao implante em um ambulatório ambulatorial especial, nos perguntamos se em uma série de pacientes com TKR complicado uma potencial sensibilidade ao metal poderia estar ligada a um quadro histológico peri-implante específico e padrão de expressão de citocinas. Para abordar a potencial relevância clínica dos achados, entramos em contato com os pacientes para ver se eles tiveram algum benefício da cirurgia de revisão, com especial atenção ao uso potencial de materiais “hipoalergênicos” após a cirurgia de revisão.

assim, o objetivo da investigação foi provar melhor a etiologia alérgica em TKR complicado, combinando diferentes etapas diagnósticas e avaliando a relevância clínica dos achados em um acompanhamento.

2. Materiais e métodos

2.1. Participaram do estudo pacientes e controles

um total de 45 pacientes. O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética. Foram analisados os seguintes grupos de pacientes.

25 artroplastia do joelho de pacientes (16 m, 9 f, 37-75 anos) com CoCrMo com base TKR e complicações, como o afrouxamento, derrames recorrentes, e a dor foram apresentadas pelo seu tratamento de cirurgiões ortopédicos para nosso ambulatório para diagnóstico de alergia, uma vez que precedem o diagnóstico não deu nenhuma indicação de problema elicitors como posicionamento errado/um alinhamento deficiente, fratura, ou infecção. De acordo com os resultados do diagnóstico de alergia, esses pacientes foram atribuídos a três grupos. Grupo I: 11 pacientes (teste de patch positivo e LTT positivo), pacientes do grupo II: 9 (teste de patch negativo e LTT positivo) e pacientes do Grupo III: 5 (Teste de patch negativo e LTT negativo).

o estudo incluiu 12 pacientes (1 m, 52-89 anos; “Grupo OA-controle”) sem implante, mas doença articular degenerativa/osteoartrite (OA) antes da artroplastia do joelho.

o estudo incluiu 8 pacientes (2 m, 53-75 anos; “Grupo PT-controle”) sem implante, mas tendo sido submetidos a teste de remendo (PT) para suspeita de doenças alérgicas da pele. 6/8 tinha reatividade Ni-PT, 2/8 não tinha reatividade Ni-PT.

nos 25 pacientes com TKR, a sensibilidade potencial do metal foi avaliada por PT e LTT; além disso, amostras de tecido periprotético foram obtidas para histologia, Análise molecular e Microbiologia. Além disso, um escore WOMAC foi obtido na visita ambulatorial para ter feedback sobre a percepção dos pacientes sobre a atividade da vida diária e da dor. Nos 12 pacientes com OA (“grupo OA-controle”), em amostras primárias de tecido TKR foram obtidas para histologia, Análise molecular e Microbiologia. Nos 8 pacientes do” Grupo PT-controle”, as biópsias foram obtidas das áreas 6 Ni-PT reativas e 2 ni-não reativas PT para histologia e análise molecular. As características dos 45 pacientes estão resumidas na Tabela 1.

2.2. Teste de Patch (PT)

Em 25 de TKR pacientes com um padrão Europeu série, de 30 de contato com alérgenos, incluindo Co, Cr e Ni preparação (Hermal, Reinbek, Alemanha), complementados por um metal alérgeno série (Brial Alérgeno GmbH, Greven, Alemanha), bem como um cimento ósseo componente de série, em caso de artroplastia cimentada foi testado em pacientes de volta. As preparações de teste foram aplicadas em câmaras Finn por 2 dias e as reações foram avaliadas no dia da remoção e 3 dias após a aplicação. Nos pacientes com teste em série de cimento ósseo, uma leitura adicional foi realizada após 1 semana. A classificação das reações cutâneas foi recomendada pelo grupo de pesquisa Alemão de dermatite de contato.

2.3. Teste de transformação de linfócitos (LTT)

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas a partir do sangue heparinizado dos pacientes com TKR por centrifugação de densidade em Ficoll-Hypaque (Phadia, Freiburg, Alemanha). As células foram cultivadas em meio RPMI1640 (Biochrom, Berlim, Alemanha) suplementado por soro autólogo, glutamina, antibiótico-Antimicótico-solução e aminoácidos não essenciais. Todas as culturas foram realizadas em quadruplicado em placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Os estímulos foram a fitohemaglutinina de mitogênio de células T pan (PHA) 2,4 µg/mL, toxóide tetânico (TT ) 5 µg/mL, NiSO4, CrCl3 e CoCl2 (7 concentrações cada de para) e meio de cultura sozinho como controle. Após 5 dias, as células foram pulsadas com timidina 3H durante a noite e a proliferação foi avaliada por radioatividade incorporada. O índice de estimulação (SI) foi calculado pela razão de contagens médias por minuto (cpm) de culturas estimuladas a não estimuladas. SI > 3 foi considerado positivo.

2.4. Análise do tecido Peri-implante

nos 25 pacientes com TKR, amostras de tecido foram obtidas da cápsula articular recém-formada no momento da revisão. Pelo menos 2 sondas foram enviadas para avaliação microbiológica para o Endoklinik Hamburg. As outras duas sondas foram processadas para histologia e uma para análise molecular. Nos 12 pacientes com OA, amostras de tecido foram obtidas no momento do implante de artroplastia primária para histologia e Análise molecular como acima. Os 8 pacientes do” Grupo PT-controle ” foram submetidos à biópsia por punção de suas áreas Ni-PT nas costas após a leitura do teste em D3. Uma sonda cada foi obtida para histologia e análise molecular.

2.5. Exame histológico

os tecidos fixos à formalina foram processados e corados com hematoxilina-eosina. A imunohistologia foi realizada com anticorpos para antígenos de células T (CD3), células B (CD20), macrófagos (CD68 resp KP1) e neutrófilos (CD15). As seções foram examinadas microscopicamente e a distribuição proporcional dos componentes do tecido, incluindo macrófagos, acúmulo difuso ou perivascular de linfócitos T ou B e células plasmáticas, bem como o padrão de reação geral da amostra de tecido, foram avaliados semiquantitativamente. O escore de classificação foi de acordo com Krenn et al. e no caso das amostras derivadas do paciente TKR, foi utilizada a classificação de consenso. Esta classificação de consenso subdivide os padrões de reação do tecido peri-implante em um corpo estranho dominado por partículas como resposta (Tipo I), um tipo infeccioso dominado por granulócitos (Tipo II), a mistura de tipos I e II (tipo combinado, tipo III) e uma reação paucicelular e bastante fibrótica (tipo IV, tipo indiferente).

2.6. Análise Molecular

as seguintes sondas foram obtidas em líquido de conservação de RNA para análise subsequente: de cada um dos 25 pacientes com TKR e 12 pacientes com OA-controle Peri-implante e tecido subcutâneo (referência) sonda; do grupo de controle do teste de remendo 6 pontas de prova Ni-PT-positivas e 2 pontas de prova do local de teste Ni-não-reativo (referência).

o RNA Total foi isolado da amostra de tecido por extração de fenol / clorofórmio e transcrito reverso em cDNA pelo uso de transcriptase reversa de AMV. A expressão das seguintes citocinas foi analisada por RT-PCR semiquantitativa no LightCycler: IFNy, TNF, IL1-β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL17 e TGFß. O valor de expressão foi determinado em comparação com o gene de manutenção da casa EF1-pelo método ΔΔCt por Schmittgen e Livak .

2.7. A comparação do escore WOMAC pré e pós-operatório

um sistema de escore modificado tem sido utilizado de acordo com a publicação de Roos et al. . A partir dos pacientes dos grupos I e II, o escore do joelho WOMAC pré-operatório estava disponível, entramos em contato com os pacientes após a cirurgia de revisão para obter também (pelo menos 6 meses após a cirurgia) suas informações de escore WOMAC pós-operatório. Foco Particular foi colocado em pacientes com revisão pelo uso de material” hipoalergênico”.

3. Resultados e discussão

a alergia a implantes metálicos continua sendo um diagnóstico de exclusão, com atraso no diagnóstico devido à falta de critérios específicos da doença e necessidade de combinar diferentes etapas diagnósticas. Assim, vários elicitores de complicações são questionados primeiro na falha do TKR e a alergia ao implante de metal é diagnosticada por uma combinação de PT, LTT e histopatologia . O estudo aqui apresentado visa apoiar a melhoria das ferramentas diagnósticas.

3.1. Diagnóstico de alergia

dentro dos 20 pacientes com sensibilidade ao metal, 11 (Grupo I) mostraram reações de PT aos metais (em parte reações múltiplas): 10 A Ni, 6 a Co, 2 A Cr, e um desses 11 pacientes também mostrou reações de PT aos componentes do cimento ósseo (para gentamicina e peróxido de benzoíla). Em 6/11, dados adicionais de LTT estavam disponíveis e mostraram reatividade de 5x Ni e 1 LTT não reativo. Nos 9 pacientes restantes (Grupo II) com PT negativo para componentes do implante, mas LTT positivo, encontramos reatividade de 9X LTT para Ni, 1x para Co. Esses dados estão resumidos nas tabelas 2-4. Em vários estudos, o aumento da sensibilidade ao metal foi encontrado em pacientes com artroplastia . Em uma escala maior, ao comparar 100 pacientes sem sintomas a 200 complicados artroplastia, tal aumento da incidência de alergia ao metal—em particular ao Ni—poderia ser reproduzido . A maioria dos dados sobre condições de liberação de metal In vivo são derivados de pacientes com Artroplastia de quadril. No entanto, a liberação local de Co e Cr também é observada no TKR e a respectiva exposição sistêmica dos pacientes é relatada . Além disso, também pode ser observada liberação substancial de Ni em pacientes com CoCrMo-artroplastia . A predominância da alergia ao Ni em nossos grupos de pacientes pode, portanto, não refletir apenas a predominância relativa da alergia ao Ni na população em geral. Por outro lado, mesmo pacientes sem sintomas com Artroplastia de joelho de bom desempenho podem ter alergia cutânea a metais de liga de implante . Assim, como Granchi et al. afirmou em 2012 que a presença de sensibilidade ao metal pode não significar mecanismo de falha do implante no nível único do paciente.

3.2. Exame histológico

em seguida, nos perguntamos se a análise do tecido periprotético ajudaria a discriminar a resposta do tecido hiperérgico. Para tanto, foram escolhidas quatro condições para análise comparativa da amostra tecidual. Por exemplo, Amostras de tecido periprotético foram obtidas de (1) Os 20 pacientes TKR com complicações e sensibilidade ao metal (grupos I e II); (2) Os 5 pacientes TKR com complicações, mas sem sensibilidade ao metal (Grupo III); (3) 12 pacientes com doença degenerativa da articulação do joelho/osteoartrite (grupo controle OA) na artroplastia primária; e (4) as biópsias cutâneas que foram realizadas em locais de PT em 8 pacientes PT (Grupo PT-controle) dos quais 6 tiveram reação PT positiva e eczematosa à Ni e 2 não tiveram reação PT à Ni. A classificação da resposta periprotética / (neo) do tecido da cápsula foi feita de acordo com a classificação de consenso padronizada inicialmente publicada por Morawietz et al. em 2006 e revisado por Krenn et al. . Além disso, o foco foi colocado na presença de linfócitos T, Linfócitos B, neutrófilos e macrófagos-e, além disso, sondas de pacientes dos grupos I, II e III também foram enviadas para avaliação microbiológica. Vários achados inesperados foram feitos: 9/11 pacientes no Grupo I e 6/9 pacientes no Grupo II tinham um tecido conjuntivo rico em fibras de colágeno, semelhante à reação do tecido periprotético (tipo IV/tipo indeterminado). E apenas 5 dos 20 pacientes sensíveis ao metal tiveram o quadro geral do” tipo induzido por partículas de desgaste ” com resposta dominada por macrófagos. Isso contrasta com a observação geral da resposta principalmente de partículas de desgaste/corpo estranho, como o padrão de tecido na artroplastia com falha e com a única reatividade de resposta Tipo IV (fibrótica) de 15% nas 370 amostras analisadas por Morawietz et al. . Não houve sinais de infecções nessas 20 amostras de nossos pacientes dos grupos I e II. Apesar de ser uma reatividade paucicelular semelhante à artrofibrose predominante, a presença de linfócitos foi observada na distribuição perivascular ou dispersa (Figuras 1(A) e 1(b)). Em contraste, dos 5 pacientes sem sensibilidade ao metal, dois apresentaram infecção e inflamação linfocítica foi observada apenas em um desses pacientes. Em pacientes com OA, novamente, infiltrados linfohistiocíticos foram observados junto com a ausência de neutrófilos. Esses achados estão resumidos nas Tabelas 2, 3 e 4. As figuras 1(a) e 1(b) são representativos de histologia resultados dos pacientes nos Grupos I e II. Biópsias de Ni-induzida alérgica teste de patch reações foram caracterizadas por infiltrado e às vezes difuso lymphohistiocytic se infiltra em conjunto com o contato de alergia, típico da epiderme muda como mostrado em uma amostra representativa (Figura 2(a)). Witzleb et al. especula-se que a presença perivascular ou difusa de linfócitos (T)no tecido periprotético poderia ser interpretada como resposta hiperérgica . No entanto, von Domarus e colegas de trabalho descreveram a infiltração de linfócitos T como um achado comum em amostras de tecido de artroplastias metal-polietileno retidas assepticamente soltas. Assim, eles concluem que nem a necrobiose nem a infiltração de linfócitos T devem ser consideradas específicas para a reação de hipersensibilidade metálica.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 1

(a) Exemplo de infiltrado linfóide infiltrar; Mancha CD3. (B) exemplo de linfócitos periprotéticos dispersos; mancha CD3.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 2

(a) Histologia do teste de patch (PT) reação de Ni mostrando infiltrado T-linfocítica se infiltra, espalhados eosinófilos, e epidérmico “spongiotic” alterações. (B) expressão do mediador inflamatório relativo na biópsia da reação positiva do PT ao Ni. Análise baseada em RT-PCR semiquantitativo em tempo real.

3.3. Perfil de expressão de citocinas

tendo em vista as publicações parcialmente inconclusivas, em seguida, nos perguntamos se a avaliação da expressão do mediador inflamatório poderia melhorar a caracterização do padrão de resposta tecidual. Na Figura 2 (b), é mostrado o padrão de expressão de Rna de citocina de uma reação aguda de hipersensibilidade cutânea específica do tipo retardado ao Ni. Os resultados principais são o upregulation marcado de IFNy como o marcador típico da resposta Th1 que estimula a resposta imune celular e de Il-2 que indica a ativação e a proliferação da T-pilha . Ao avaliar os grupos de pacientes com TKR de metal com/sem sensibilidade ao metal e grupo controle de OA, essa regulação positiva do IFNy também foi particularmente visível em pacientes do Grupo I, por exemplo, TKR com complicações e reatividade ao teste de patch para metais. De outros mediadores avaliados, no TKR pacientes IL-2 expressão foi mais proeminente no Grupo I e no OA-Grupo de doentes e TGF-ß expressão ligeiramente mais nos Grupos I e II. É também este o caso de IL-6 (Grupos I e II) e um paciente no Grupo II (pacientes com periprosthetic infecção). Esses outros mediadores não são mostrados, pois houve apenas algum aumento individual de TNF em pacientes com OA, mas nenhuma grande diferença entre os diferentes grupos. O aumento do compromisso da linhagem TH1 é refletido pelo aumento da expressão IFNy. Aqui encontramos marcada regulação positiva do IFNy não apenas tipicamente nas reações de PT induzidas pelo Ni, mas em particular também nos pacientes do Grupo I TKR, sugerindo seu papel na progressão da doença periprotética. Curiosamente, Jämsen e colegas de trabalho relataram recentemente que encontraram células T CD3 + espalhadas no tecido de interface da artroplastia de quadril assepticamente solta com resposta predominante de partículas de desgaste relacionadas a macrófagos. No entanto, nem por PCR quantitativo nem por imunohistoquímica, eles poderiam mostrar expressão mediadora significativa de TH1 (ou seja, IFNy) ou TH2 (IL-4). Uma vez que, além da IL-6 , em particular, o TGF-ß pode desempenhar um papel central no início e persistência da fibrose articular periprotética, Analisamos aqui sua respectiva expressão nas diferentes amostras de tecido. Observou-se aumento da expressão de TGF-ß nos pacientes com TKR sensíveis ao metal, com variações interindividuais. As figuras 3 (a) -3(c) resumem esses achados.

(a)

b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

(a) expressão de Citocinas de IFNy nos tecidos das 5 diferentes grupos de pacientes; expressão de citocinas foi analisada em comparação com a manutenção da casa do gene-EF-1 e para o controle de pacientes tecido pelos ΔΔCt-método ; (Wilcoxon-Mann-Whitney, teste feito pelo software estatístico SPSS). (B) expressão de citocinas de IL-2 nos tecidos dos 5 diferentes grupos de pacientes; a expressão de citocinas foi analisada em comparação com o gene de manutenção da casa EF-1 e para o tecido de controle dos pacientes pelo método ΔΔCt; (Wilcoxon-Mann-Whitney-teste feito pelo software estatístico SPSS). (c) expressão de Citocinas de TGFß nos tecidos das 5 diferentes grupos de pacientes; expressão de citocinas foi analisada em comparação com a manutenção da casa do gene-EF-1 e para o controle de pacientes tecido pelos ΔΔCt-(método de Wilcoxon-Mann-Whitney, teste feito pelo software estatístico SPSS).

3.4. Comparação do escore WOMAC pré e pós-operatório

19 dos 20 pacientes com TKR responderam ao nosso pedido e completaram um escore WOMAC pós-operatório. 9 pacientes relataram que na revisão um TKR” hipoalergênico ” havia sido implantado (revestimento de superfície à base de 8x Ti, implante à base de 1x oxínio). 8/9 pacientes lucraram com essa abordagem, conforme mostrado na Figura 4. Até agora, existem apenas relatos de casos ou pequenas séries de pacientes em relação ao benefício potencial do uso de TKR “hipoalergênico”. Esses resultados, no entanto, enfatizam a necessidade de estudos de acompanhamento em maior escala.

Figura 4

WOMAC pontuação antes e depois de cirurgia de revisão em 9 pacientes que receberam “hipoalergênico” material (8x de titânio, 1x oxinium). O sistema de pontuação tem sido utilizado de acordo com a publicação de Roos et al. .

no entanto, Existem limitações no estudo: os fatos de que as amostras de tecido periprotético podem refletir apenas o estágio real de um processo dinâmico e que os pacientes com OA podem não ser tão bem um “controle” quanto as sondas de tecido de interface de pacientes com implantes de bom funcionamento e o número limitado de amostras nesta investigação. Assim, mais estudos são necessários para validar a abordagem diagnóstica multimodular na alergia a implantes metálicos.

4. Conclusões

este estudo demonstra pela primeira vez o potencial de utilizar etapas analíticas combinadas para fornecer uma abordagem para desenvolver características diagnósticas de alergia a implantes metálicos. O diagnóstico de alergia (PT e LTT) e a histologia periprotética apontam para a resposta imunológica aos metais de liga de implante e o padrão de expressão do mediador inflamatório aumenta a diferenciação funcional.

achados inesperados foram a resposta predominante da interface” fibrótica ” tipo IV nos pacientes TKR sensibilizados com metal e a expressão marcada de IFNy nos pacientes TKR PT-positivos.

conflito de interesses

os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Concessão de Endo-Stiftung, em Hamburgo, e Concessão de B Braun-Aesculap, Tuttlingen e Ludwig-Maximilians de Munique.