Exclusão de KDM6A, uma Histona Demethylase Interagindo com MLL2, em Três Pacientes com a Síndrome de Kabuki | Jumbuck

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síndrome de Kabuki (KS; a MIM 147920) foi descrita pela primeira vez em 1981 por distritos de niikawa e Kuroki,1,2 e mais de 400 casos foram relatados na literatura. As principais características clínicas são características faciais distintas, atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual leve a moderada, retardo de crescimento pós-natal e características adicionais, incluindo anomalias esqueléticas, hipodontia e almofadas persistentes da ponta do dedo fetal. A análise comparativa de Microarray de hibridização genômica (CGH) não conseguiu detectar uma anomalia recorrente em 72 indivíduos KS.3-8 o uso da estratégia de sequenciamento de Exoma recentemente levou à identificação de mutações MLL2 (MIM 602113) como uma das principais causas de KS.9 em cinco séries recentemente publicadas, mutações em MLL2 foram encontradas em 56% -76% dos pacientes com SK.9-13

porque uma proporção significativa de pacientes não tem uma mutação MLL2 detectável, postulamos a existência de genes adicionais associados ao KS. Na busca por uma outra mutação genética causadora de KS, dez genes interagindo com MLL2 foram selecionados em 15 indivíduos KS negativos para mutação MLL2, e nenhuma mutação patogênica foi identificada.11 outro gene que codifica uma proteína de interação MLL2, KDM6A (anteriormente conhecido como UTX; MIM 300128), foi rastreado em 22 indivíduos KS negativos para mutação MLL2 e, novamente, nenhuma mutação causadora foi detectada.13

usando a análise do CGH da disposição (plataforma 244k de Agilent), nós identificamos de novo Xp11.3 microdeletions em duas meninas belgas de MLL2-mutation-negative KS (pacientes 1 e 2). Como ambas as exclusões eram de novo, elas provavelmente são patogênicas. Ambas as exclusões incluíram uma parte ou toda a KDM6A. além disso, não houve exclusões de KDM6A em uma coorte de 411 controles normais em um estudo anterior.14 a deleção no paciente 1 incluiu exons KDM6A 21-29, que codificam para a parte terminal do domínio catalítico de KDM6A, e CXorf36, um gene recentemente implicado no autismo ligado ao X.15 No paciente 2, KDM6A, CXorf36, DUSP21 MIM (300678), e FUNDC1 (Figura 1) foram removidos completamente. As funções de DUSP21 e FUNDC1 permanecem desconhecidas.

Região Xp11.3 Mostrando os Pacientes Exclusões

Região Xp11.3 mostra as eliminações elaborado a partir da UCSC Genome Browser (GRCh37/hg19) para os pacientes 1, 2 e 3. As faixas pretas completas representam a exclusão de cada paciente e o número de cada paciente está acima de sua respectiva faixa. A deleção no paciente 1 abrange 283,5 kb da base 44.941.324 à base 45.224.829, a deleção do paciente 2 abrange 815.7 kb da base 44.377.858 à base 45.193.629, e a exclusão do paciente 3 abrange 45,4 kb da base 44.866.302 à base 44.912.718. Os genes na área são anotados abaixo das faixas de exclusão. CNVs no banco de dados de variantes genômicas são mostrados nas linhas de fundo. Não há relatórios anteriores de alterações de número de cópia KDM6A.

em seguida, sequenciamos o KDM6A por sequenciamento de Sanger e procuramos exclusões ou duplicações intragênicas com uma matriz agilente personalizada direcionada CGH em uma coorte de 22 indivíduos KS negativos para mutação MLL2 (8 mulheres, 14 homens). De acordo com os padrões éticos do Comitê de Ética do Institut de Pathologie et de Génétique, foi obtido o consentimento dos pais para a análise de DNA de todos os participantes deste estudo e para a publicação de fotografias. Os dados de microarray CGH (dados suplementares, disponíveis online) discutidos nesta publicação foram depositados no National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO)16 e estão acessíveis sob adesão GSE32567 (ver seção de números de Adesão).

nenhuma mutação pontual foi detectada, mas identificamos uma deleção intragênica de novo (exons 5-9) em um indivíduo Italiano, masculino KS (paciente 3). Também sequenciamos UTY (MIM 400009), o paralog do cromossomo Y de KDM6A (veja abaixo), e procuramos deleções ou duplicações intragênicas conforme declarado acima, mas não detectamos nenhuma mutação.

os pacientes 1 e 3 apresentaram fenótipo KS típico, incluindo fissuras palpebrais longas, eversão lateral da pálpebra inferior e incapacidade intelectual moderada a grave (Tabela 1 e Figura 2). Embora as características faciais do paciente 2, não foram tão clássica, ela demonstrou muitas características do transtorno, incluindo lateral escassez de sobrancelhas, cílios longos, estrabismo, longa palpebral fissuras, grandes e orelhas proeminentes, persistente fetal dedo almofadas, coarctação de aorta, areolar plenitude na infância, e hirsutismo. Ela apresentou um leve atraso no desenvolvimento e teve um escore normal de quociente de inteligência verbal (QI), um escore de QI de baixo desempenho e comportamento hiperativo (Tabela 1 e Figura 2). Observamos que os pacientes 1 e 2 tiveram alucinações longas (Figura 3).

aparência Facial em indivíduos afetados

(a) paciente 1.

(B) Doente 2.

(C) Doente 3.

observe as fissuras palpebrais longas nos pacientes 1 e 2 e as sobrancelhas arqueadas nos pacientes 1 (leve) e 3.

aparência dos pés em indivíduos afetados

(a) paciente 1.

(B) Doente 2.

observe as longas alucinações em ambos os pacientes.

assim, as exclusões de KDM6A nesses três pacientes estão associadas a um amplo espectro fenotípico que varia de indivíduos típicos de KS (pacientes 1 e 3) a uma apresentação clínica mais branda (paciente 2). Essa variabilidade clínica também é uma característica de pacientes com mutações MLL2.13 no entanto, os possíveis efeitos da deleção de CXorf36 no paciente 1 e de deleção de CXORF36, DUSP21 e FUNDC1 no paciente 2 em seus respectivos fenótipos também devem ser considerados.

KDM6A (29 exons) é um dos genes cromossômicos X que escapa em grande parte da inativação X.17 codifica uma proteína de resíduo 1,401 que contém dois domínios funcionais. O domínio catalítico é uma histona demetilase que catalisa especificamente a desmetilação da lisina 27 mono, di e trimetilada na histona H3 (H3K27).18,19 essa desmetilação medeia a expressão específica do tecido de vários genes e está envolvida principalmente nos processos de desenvolvimento e no ciclo celular.19-22 curiosamente, KDM6A e MLL2 atuam juntos no controle epigenético da cromatina transcricionalmente ativa, neutralizando as proteínas do Grupo Policomb (PcG).22 outro domínio funcional do KDM6A desempenha um papel na remodelação da cromatina interagindo com o parâmetro/sacarose nonfermentable (SWI/SNF) remodelação do complexo que contém o ativador de transcrição Brg1.23

Como MLL2, KDM6A desempenha um papel na embriogênese e desenvolvimento. Homozigoto dUTX (Drosophila kdm6a ortholog) Drosophila mutantes manifestam olhos ásperos, asas dismórficas e modificação dos pentes sexuais.21 esse fenótipo se assemelha ao fenótipo tritórax, apoiando ainda mais a noção de que o KDM6A neutraliza a repressão do PcG.21 além disso, UTX-1 (C. elegans kdm6a ortholog) pode afetar as decisões do destino do desenvolvimento em células precursoras vulvais de C. elegans por meio da regulação da transcrição de genes que codificam o complexo proteico de retinoblastoma (RB), que foi conservado de vermes para humanos.20 Kdm6a1 também é importante na expressão de genes HOX posteriores em peixes-Zebra.19 além disso, o KDM6A, juntamente com o MLL2, desempenha um papel importante na regulação de genes específicos do músculo durante a embriogênese.22,24 finalmente, membros de outra importante família de genes do desenvolvimento (genes t-box, que atuam no mesoderma na formação do coração e das vértebras) recrutam KDM6A para ativar seus genes-alvo, enfatizando novamente o papel do KDM6A nos processos de desenvolvimento.Curiosamente, a maioria das mutações patogênicas para genes t-box relatados em doenças humanas estão localizadas no domínio t-box que interage com KDM6A.23

kdm6a escapa à inativação X,17 mas foi sugerido que, em camundongos, a expressão de Kdm6a do cromossomo X inativo é significativamente menor do que a do cromossomo X ativo.A expressão de 25 Kdm6a é maior no cérebro adulto, no fígado adulto e em regiões cerebrais específicas em desenvolvimento em mulheres do que em homens.25 UTY é o paralog de KDM6A no cromossomo Y.17 UTY tem 84% de similaridade de sequência de aminoácidos com KDM6A e pode compensar o aumento da expressão de KDM6A em mulheres, apesar do fato de que a atividade da desmetilase ainda não foi demonstrada para este paralog KDM6A.14,25

não é surpreendente encontrar outro gene associado ao KS no cromossomo X porque houve relatos de pacientes semelhantes ao KS com cromossomos pequenos do anel X (r).Além disso, há uma clara sobreposição entre os defeitos cardíacos congênitos prevalentes em pacientes do sexo masculino com SK (coarctação aórtica e outras obstruções do lado esquerdo) e aqueles encontrados em pacientes com monossomia X e cromossomos r(X).28,35 pequenos cromossomos r (X) normalmente levam à síndrome de Turner através da inativação completa do r(X). No entanto, não está claro por que alguns indivíduos desenvolvem um fenótipo semelhante ao KS. A inativação incompleta do cromossomo X e a expressão subsequente de genes geralmente reprimidos foram sugeridas como uma explicação para o fenótipo KS em alguns pacientes r(X).32-34 KDM6A foi excluído nos três pacientes que tinham um fenótipo semelhante ao KS e um r(X) no qual os pontos de interrupção foram mapeados; esse achado é consistente com a hipótese de que a deleção de KDM6A desempenha um papel importante no fenótipo semelhante ao KS observado em alguns pacientes com um r(X).30,32,34 não conseguimos comprovar a haploinsuficiência para KDM6A nos pacientes 1 e 2 porque a expressão de KDM6A era muito baixa nos linfócitos do sangue periférico (dados não mostrados). No entanto,estudos mostraram que duas cópias de Kdm6a são necessárias para a expressão normal em embriões de camundongos fêmeas e camundongos adultos, 25 sugerindo que a haploinsuficiência pode ser o mecanismo patogênico. No entanto,essa explicação não explicaria o fato de que 45, X e outros pacientes r(X) com deleção de KDM6A nem todos desenvolvem o fenótipo Kabuki.

nos pacientes 1 e 2, as razões de inativação molecular X são fortemente distorcidas e são 89:11 e 97:3, respectivamente. O perfil de inativação X foi determinado por meio de amplificação por PCR da repetição CAG no exon 1 do gene do receptor de andrógeno antes e depois da digestão do DNA com HpaII e CfoI. Para determinar se a cópia excluída do KDM6A estava localizada no cromossomo X ativo ou inativo, realizamos a análise de hibridização in situ de fluorescência (FISH) com uma sonda KDM6A nos cromossomos X que havia sido marcada diferencialmente pela incorporação de 5-bromo-2′-desoxiuridina (5-BrdU). Os resultados mostraram que a cópia excluída do KDM6A estava localizada no cromossomo X inativo em todas as 70 mitoses analisadas em ambos os pacientes (Figura 4). O fato de que kdm6a escapa x-inativação17 sugere que os linfócitos estimulados pela fitohemaglutinina (PHA) que têm uma cópia excluída do KDM6A no cromossomo X inativo têm uma vantagem de sobrevivência sobre as linhas celulares que têm uma cópia excluída do KDM6A no cromossomo X ativo. Essa sugestão está de acordo com a hipótese de que, embora KDM6A escape da inativação X, sua expressão é menor do cromossomo X inativo do que do cromossomo X ativo.25

Imagem do PEIXE Estudo de Cromossomos X Diferencialmente Rotulado com 5-BrdU

Uma imagem de um PEIXE estudo mostra cromossomos X, diferencialmente rotulado pela incorporação de 5-BrdU. O cromossomo X inativo (no círculo branco) parece mais brilhante que o cromossomo X ativo. As sondas subteloméricas xqter hibridizam para ambos os cromossomos X (setas azuis). O sinal KDM6A (seta branca) está ausente do cromossomo X inativo e está presente no cromossomo X ativo. Para este experimento, os linfócitos do sangue periférico dos pacientes 1 e 2 foram estimulados com fitohemaglutinina e foram cultivados por 72 horas. para identificar o cromossomo X inativo de replicação tardia, Tratamos as células com 5-BrdU (30 µg/ml) 5 horas antes da colheita. Colcemid foi então adicionado a uma concentração de 0,2 µg / ml, e 1 hora depois, preparações metafásicas foram produzidas por meio de procedimentos padrão envolvendo inchaço em 75 mM KCl e fixação em 3:1 metanol/ácido acético. Realizamos PEIXE análise em simultâneo através de uma subtelomeric Xqter sonda marcada com SpectrumOrange (Vysis) para indicar o cromossomas X (seta azul) e RP11-435K1 rotulado com SpectrumOrange (AmpliTech) para distinguir entre o excluído e nondeleted cromossomas X (seta branca). Para facilitar a detecção de 5-BrdU incorporados, desnaturamos DNA celular em 2N HCl por 30 min a 37°C. 5-BrdU foi então rotulado com um anticorpo monoclonal específico de 5-BrdU conjugado à fluoresceína (Roche) (1 µg/ml). Por fim, contraestainamos o DNA aplicando uma solução antifade contendo 0.1 µg / ml de DAPI.

o papel da UTY é amplamente desconhecido e não tem atividade de desmetilase in vitro. A descoberta de um macho KS indivíduo (paciente 3) com uma intragenic eliminação de KDM6A e com gravidade clínica semelhante à do paciente 1 sugere que UTY pode compensar parcialmente a perda de KDM6A em indivíduos do sexo masculino, como anteriormente sugerido na literatura.25

Como para MLL2, somáticas homozigotos e hemizigoto mutações no KDM6A têm sido identificados em vários tipos de cancro (mieloma múltiplo, esôfago carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renais, leucemia mielóide aguda, câncer de mama, câncer colorretal, e glioblastoma), sugerindo que KDM6A é um tumor gene supressor.14 No entanto, o câncer não é uma característica fundamental da SK, uma vez que essa complicação foi relatada em apenas sete pacientes com SK36,37 (leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Burkitt, sarcoma fibromixóide, sarcoma sinovial e hepatoblastoma foram relatados uma vez e neuroblastoma foi relatado em dois indivíduos com SK).35,36 se a perda de ambos os alelos for suficiente para causar câncer, seria de esperar que o câncer ocorra com mais frequência em KS, como em retinoblastoma (MIM 180200) ou tumor de Wilms (MIM 194070). Isso sugere que a perda do segundo Alelo em MLL2, KDM6A ou UTY é necessária, mas não suficiente para o desenvolvimento do câncer ou que essa complicação é subreconhecida, demonstrando a importância dos estudos de História natural em síndromes raras.37

O seguinte histona methylases e histona demethylases têm sido implicados em outros vários de anomalias síndromes: EHMT1 MIM (607001; Kleefstra síndrome ), SETBP1 MIM (611060; Schinzel-Giedion síndrome ), JARID1C MIM (314690; Claes-Jensen-tipo, ligadas ao X mental retardation síndrome ), PHF8 MIM (300560; Siderius-tipo, síndrome de retardo mental ligada ao X) e MLL2 em KS. A identificação de mutações patogênicas KDM6A em pacientes com SK expande o papel dos fatores de modificação da histona na deficiência intelectual e malformação congênita.

em conclusão, relatamos mutações KDM6A como causa de KS em um homem e duas mulheres. Nossos achados confirmam a heterogeneidade genética do KS e um locus no cromossomo X, como foi sugerido anteriormente. Como alguns pacientes com SK foram negativos para mll2, KDM6A e sequenciamento UTY e não mostraram exclusões ou duplicações durante a triagem, é provável que outros genes associados ao SK ainda não tenham sido descobertos.