purificação e caracterização da Asparaginase de sementes de Phaseolus vulgaris

resumo

a l-asparaginase de bactérias tem sido utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. O objetivo deste estudo foi purificar e caracterizar a l-asparaginase a partir de sementes de Phaseolus vulgaris em vez de fontes microbianas. A l-asparaginase foi purificada para aparente homogeneidade. A enzima tem massa molecular de 79 kDa. A asparaginase purificada tinha uma atividade muito baixa em relação a vários análogos de asparagina e glutamina. A l-asparaginase estava livre da atividade da glutaminase. Os parâmetros cinéticos, Km e Vmax da enzima purificada, foram encontrados em 6,72 mM e 0,16 µM, respectivamente. A enzima teve pH ótimo em 8,0. A enzima mostrou uma alta estabilidade em pH alcalino (pH 7.5–9.0) quando incubados por até 24 h. A L-asparaginase, tinha a mesma temperatura ideal e estabilidade térmica a 37°C. K+ foi capaz de aumentar consideravelmente a atividade de asparaginase por 150%, em comparação com outros metais testados. Em conclusão, a l-asparaginase não mostrou atividade de glutaminase e boa estabilidade em uma ampla gama de condições fisiológicas e, portanto, poderia ser usada como potencial candidato para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda.

1. Introdução

l-asparaginase (l-asparagina amidohidrolase E. C. 3.5.1.1) é utilizado no tratamento de leucemia linfoblástica aguda e linfoma não-Hodgkin . O uso da L-asparaginase na terapia anticancerígena baseia-se em sua capacidade de clivar a l-asparagina, um aminoácido essencial para o crescimento dos linfoblastos, à amônia e ao ácido L-aspártico no soro e no líquido cefalorraquidiano, uma vez que os linfoblastos são incapazes de produzir l-asparagina endógena, o que leva à morte dessas células . A maioria das células cancerosas depende de uma fonte exógena desse aminoácido para a sobrevivência. No entanto, as células normais são capazes de sintetizar l-asparagina e, portanto, são menos afetadas por sua rápida depleção devido ao tratamento com esta enzima. A l-asparaginase também pode ser usada para reduzir a formação de acrilamida em alimentos fritos e cozidos no forno, especialmente em batatas fritas . A formação de acrilamida foi atribuída à reação de asparagina livre e açúcares redutores . A depleção de asparagina por asparaginase impediu a formação de acrilamida .

a l-asparaginase é amplamente distribuída entre plantas, animais e microorganismos . Na planta, esta enzima foi detectada pela primeira vez nas sementes em desenvolvimento de Lupinus albus . A Asparaginase também foi purificada a partir do teste de sementes maduras de L. polyphyllus . Duas formas da enzima foram identificadas. Uma forma independente de K + é encontrada em L. arboreus e L. polyphyllus e uma forma dependente de K+é encontrada em Pisum sativum e várias outras espécies de leguminosas, incluindo outras espécies de Lupinus . O trabalho com anticorpos para a forma independente de K + de L. polyphyllus não revelou reação cruzada com asparaginase de ervilha ou várias variedades de Lupinus contendo a enzima dependente de K+, sugerindo que as duas formas de asparaginase são imunologicamente distintas .

muito pouca informação foi relatada sobre o uso de asparaginase vegetal no tratamento da leucemia linfoblástica aguda . Portanto, o objetivo principal deste estudo foi purificar e caracterizar a l-asparaginase a partir de sementes de Phaseolus vulgaris livres de l-glutaminase em vez de l-asparaginase de fontes microbianas que é usada como anticâncer e causou efeitos colaterais devido às suas respostas imunológicas.

2. Material e métodos

2.1. Materiais vegetais

sementes maduras de Phaseolus vulgaris cv. Gizé 6 foi obtido no centro de Pesquisa Agrícola, Cairo, Egito.

2.2. Purificação da Asparaginase

2.2.1. Extrato bruto

o extrato bruto de asparaginase foi preparado por homogeneização de 50 g de sementes de Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 em tampão Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 contendo 10% de glicerol, 50 mM de KCl, 12,5 mM de β-mercaptoetanol e 1 mM de PMSF. O homogenato foi centrifugado a 10.000 ×g e o sobrenadante foi designado como extrato bruto. O extrato bruto foi concentrado por diálise contra sacarose sólida.

2.2.2. A coluna Deae-Sepharose

extrato bruto concentrado foi aplicada em uma coluna DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm I. D.) que foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0. A enzima foi eluída por diferentes concentrações de KCl preparadas no mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 60 mL/h E foram coletadas frações de 3 mL. Três picos de proteína foram eluídos com atividade de asparaginase de acordo com a ordem de eluição (asparaginases I, II e III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginase I com maior atividade foi aplicado em uma coluna Sephacryl S-200 (90 × 0.6 cm I. D.) que foi previamente equilibrado com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 30 ml/h e frações de 3 mL foram coletadas.

2.3. Ensaio de Asparaginase

a atividade da L-asparaginase foi medida pelo método modificado de Wriston . A l-asparaginase catalisa L-asparagina em ácido L-aspártico e amônia e esta última reage com o reagente de Nessler para produzir um produto de cor laranja. A mistura de ensaio enzimático consistiu em 900 µL de l-asparagina recém-preparada (20 mM) em tampão Tris-HCl de 50 mM (pH 8,0), 50 mM KCl e 100 µL de extrato bruto da enzima. A mistura de reação foi incubada a 37°C por 30 min e a reação foi interrompida pela adição de 100 µL de ácido tricloroacético a 15%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 ×g por 5 min a 4°C Para remover os precipitados. A amônia liberada no sobrenadante foi determinada usando técnica colorimétrica adicionando 100 µL de reagente de Nessler na amostra contendo 100 µL de sobrenadante e 800 µL de água destilada. O conteúdo da amostra foi vortexado e incubado à temperatura ambiente por 10 min e od foi medido a 425 nm. A amônia produzida na reação foi determinada com base na curva padrão obtida com sulfato de amônio. Uma unidade de atividade da L-asparaginase é definida como a quantidade da enzima que libera 1 µmol de amônia por min a 37°C.

2,4. A determinação da proteína

foi quantificada pelo método de Bradford com albumina sérica bovina como padrão.

2.5. Determinação do peso Molecular

o peso molecular nativo foi determinado por Sephacryl S-200. A coluna foi calibrada com citocromo C( 12.400), anidrase carbônica (29.000), albumina sérica bovina (67.000), álcool desidrogenase (150.000) e β-amilase (200.000). Dextran blue (2.000.000) foi usado para determinar o volume vazio (Vo). O peso molecular da subunidade foi estimado pela eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida . Para a curva de calibração foram utilizadas fosforilase B desnaturada por SDS (94.000), albumina sérica bovina (67.000), ovalbumina (43.000), anidrase carbônica (30.000), inibidor de tripsina de soja (20.000) e α-lactalbumina (14.200).

2.6. Caracterização da Asparaginase

2.6.1. Especificidade do substrato

a atividade da Asparaginase foi determinada com alguns análogos da L-asparagina. A atividade relativa foi expressa como a razão percentual da atividade enzimática determinada contra diferentes análogos de estrutura da L-asparagina para a atividade enzimática com L-asparagina.

2.6.2. Parâmetros cinéticos

Os valores de Michaelis constantes (Km) e velocidade máxima (Vmax) foram determinados usando L-asparagina como substrato na faixa de 2-20 mM. Parâmetros cinéticos foram determinados a partir de Lineweaver-Burk enredo.

2.6.3. Efeito do pH

o pH ótimo para a atividade da asparaginase foi determinado pela avaliação da atividade em diferentes valores de pH. A estabilidade do pH foi testada por incubação da enzima em pH de 5,0 – 9,0 por 24 h a 4°C na ausência de substrato e a atividade residual foi determinada sob as condições padrão de ensaio.

2.6.4. Efeito da temperatura

a temperatura ideal para a atividade da asparaginase foi determinada pela análise da enzima em diferentes temperaturas. A estabilidade térmica foi medida incubando a enzima sozinha em diferentes temperaturas por 1 h. Após o tratamento térmico, a solução enzimática foi resfriada e a atividade residual foi avaliada após a adição dos substratos.

2.6.5. Efeito do íon metálico

os efeitos de vários íons metálicos na atividade enzimática foram determinados preincubando a enzima isoladamente com íons metálicos de 10 mM por 15 min antes da adição do substrato. A atividade que foi testada na ausência de íons metálicos foi tomada como 100%.

3. Resultados e discussão

os resultados das etapas de purificação da asparaginase de P. vulgaris estão resumidos na Tabela 1. O perfil de eluição da cromatografia na coluna DEAE-Sefarose (Figura 1) mostrou três picos de proteínas com atividade de asparaginase. O pico um com a maior atividade de asparaginase foi aplicado em uma coluna Sephacryl S-200 (Figura 2). A l-asparaginase I foi purificada 21,7 vezes com uma atividade específica 846 unidades/mg de proteína. A asparaginase I provou ser pura após a coluna Sephacryl S-200, conforme avaliado pelo SDS-PAGE (Figura 3). O peso molecular da asparaginase i pelos procedimentos Sephacryl S-200 e SDS-PAGE produziu um valor de 79 kDa como subunidade monomérica. Este achado está de acordo com pesos moleculares para asparaginases de Vigna unguiculata (70 kDa) e Lupinus polyphyllus (75 kDa) . Um peso molecular médio de 58 kDa foi detectado para asparaginase de folhas de ervilha . Para asparaginases bacterianas, o peso molecular variou de 140 a 160 kDa com subunidades de tetramer . Um peso molecular muito baixo de 11,2 kDa foi detectado para Streptobacillus sp. Kk2s4 asparaginase .

Figura 1

Um típico perfil de eluição para a cromatografia de asparaginase de P. vulgaris em DEAE-Sepharose coluna (15 × 1,6 cm eu.d.) previamente equilibrado com tampão Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 a uma taxa de fluxo de 60 mL/h E 3 ml de frações.

Figura 2

Gel filtração de asparaginase eu de DEAE-Sepharose fração em Sephacryl S-200 de coluna (90 × 1,6 cm eu.d.). A coluna foi equilibrada com tampão Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 a uma taxa de fluxo de 30 mL/h E 3 ml de frações.

Figura 3

SDS-PAGE para a homogeneização e a determinação de pesos moleculares de asparaginase eu de Phaseolus vulgaris. (1) marcadores proteicos; (2) sephacryl S-200 asparaginase I.

a especificidade do substrato da asparaginase I foi examinada usando vários análogos de asparagina e glutamina (Tabela 2). A atividade com a l-asparagina foi considerada 100% de atividade. A DL-asparagina exibiu 30% da atividade enzimática, onde a DL-asparagina é composta por um : 1 mistura racêmica. D-asparagina, ácido L-aspártico e análogos do ácido L-glutâmico tiveram atividade muito baixa em relação à asparaginase I. nenhuma atividade foi detectada na presença de L-glutamina. Portanto, a asparaginase I de P. vulgaris está livre de glutaminase. A contaminação da asparaginase com a atividade da glutaminase causou efeitos colaterais durante o curso da terapia anticâncer . O L. arboreus asparaginase hidrolisado apenas L-asparagina e DL-aspartil hidroxamato . A V. unguiculata asparaginase foi específica para L-asparagina, não hidrolisou d-asparagina e não foi específica para L-glutamina .

os parâmetros cinéticos, Km e Vmax da enzima purificada, apresentaram asparagina de 6,72 mM e amônia de 0,16 µM/mL, respectivamente (Figura 4). Valores semelhantes de Km de 6,6 e 7,0 mM foram determinados para asparaginases de L. arboreus e L. angustifolius, respectivamente . Asparaginase de sementes de Lupinus tem alto Km para asparagina (12,2 mM) . Baixo Km (1.2 mM) foi determinado para asparaginase de V. unguiculata . Para as bactérias, os valores de Km Para l-asparaginase de Escherichia coli e Erwinia carotovora foram de 3,5 e 7,14 mM, respectivamente .

Figura 4

Lineweaver-Burk parcela relativa de asparaginase eu a partir de P. vulgaris velocidades diferentes de L-asparagina concentrações.

a Asparaginase I apresentou pH ótimo em 8,0 (Figura 5). Entre pH 6,0 e 9,0, mais de 50% de sua atividade foi mantida. Embora a atividade máxima no pH fisiológico seja um dos pré-requisitos da L-asparaginase para a atividade antitumoral, a enzima purificada seria útil porque 80% da atividade enzimática foi retida em pH 7,5. A enzima apresentou estabilidade em pH alcalino (pH 7,5–9,0), pois manteve 90% de sua atividade original quando incubada até 24 h (Figura 6). No entanto, o pH ótimo das L-asparaginases de várias plantas variou de 8,0 a 8,5 . A maioria das L-asparaginases de bactérias mostrou pH alcalino optima (8,0–10) .

Figura 5

pH ótimo da asparaginase I de P. vulgaris. A atividade enzimática foi medida em vários ph’s usando o método de ensaio padrão, conforme descrito anteriormente.

Figura 6

o pH de estabilidade de asparaginase eu a partir de P. vulgaris em diferentes pH após a incubação por 24 h a 4°C.

Asparaginase eu foi encontrado para ter a temperatura ótima de 37°C (Figura 7). Foi relatada temperatura ótima semelhante da asparaginase de V. unguiculata (40°C). Essa temperatura também foi semelhante à relatada para Pseudomonas aeruginosa e pectobacterium carotovorum . A atividade ideal do Streptobacillus sp. a asparaginase foi registrada a 35°C. Pelo contrário, L-asparaginase de Chrombacteriaceae e Proteus vulgaris foi observada a 20°C e 57°C, respectivamente . Foi detectada uma relação não linear entre asparaginase I e estabilidade de temperatura (Figura 8). A atividade enzimática foi estável até 37°C após incubação por 1 h. Asparaginase de V. unguiculata foi estável até 40°C após incubação por 15 min . Asparaginases de P. carotovorum e C. annuum mantiveram sua atividade inicial após incubação a 40°C e 45°C por 60 min, respectivamente .

Figura 7

temperatura ótima da asparaginase I de P. vulgaris. A atividade enzimática foi medida em várias temperaturas usando o método de ensaio padrão, conforme descrito anteriormente.

Figura 8

a estabilidade Térmica de asparaginase eu a partir de P. vulgaris. A mistura de reação foi pré-incubada em várias temperaturas por 60 min antes da adição do substrato, seguida de resfriamento em banho de gelo. A atividade enzimática foi medida usando o método de ensaio padrão, conforme descrito anteriormente. A atividade em tempo zero foi tomada como 100% de atividade.

o efeito de diferentes íons metálicos na asparaginase I foi examinado (Tabela 3). Os íons metálicos foram usados na concentração de 10 mM. K+ foi capaz de aumentar significativamente a atividade da asparaginase I em 150%. Na planta, asparaginases independentes de K+e dependentes de K+foram identificadas . K + atuou também como potenciador da P. carotovorum asparaginase . Ca2+ ligeiramente melhorada a atividade de 110%, mas Cu2+ um pouco inibido a atividade de asparaginase I. além disso, Pb2+ e Hg2+ causada parcialmente o efeito inibitório sobre asparaginase I. no Entanto, V. unguiculata asparaginase foi ativado por Ni2+ e Co2+ e foi inibida por Mn2+, Zn2+, Ba2+ e Hg2+ . EDTA como agente quelante metálico causou efeito parcialmente inibitório na asparaginase I. No entanto, EDTA não teve efeito sobre P. carotovorum asparaginase .

4. Conclusões

a l-asparaginase I de P. vulgaris foi purificada na forma livre de glutaminase, o que pode reduzir a possibilidade de efeitos colaterais durante o curso da terapia anticâncer. A enzima mostrou boa estabilidade em uma ampla gama de condições fisiológicas como pH e temperatura. Na próxima etapa do nosso projeto, A L-asparaginase I de P. vulgaris será usada como um potencial candidato para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda.

conflito de interesses

os autores não têm conflito de interesses relevantes para este artigo para divulgar.

agradecimentos

este projeto foi financiado pelo Plano Nacional de Ciência, Tecnologia e inovação (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Arábia Saudita, prêmio no. (11-BIO-1516-03). Os autores também reconhecem com agradecimento a unidade de Ciência e Tecnologia, Universidade King Abdulaziz, pelo suporte técnico.