C. poliacrilamida embutida com contas fluorescentes
conforme descrito na seção anterior, substratos de silício provaram ser valiosos na medição das forças exercidas pelos queratócitos em movimento rápido. No entanto, esses mesmos substratos são muito menos úteis para estudar a maioria das células de mamíferos. Para que as trações sejam calculadas com precisão, o substrato deve ser ajustado para corresponder à motilidade e geração de força de um determinado tipo de célula. É difícil produzir com precisão um substrato de silício de Conformidade desejada para células de movimento mais lento capazes de exercer forças superiores. Para superar essa limitação, Dembo e Wang (1999) usaram um substrato de poliacrilamida incorporado com contas fluorescentes do tamanho de submicrômetro. A conformidade dos substratos de poliacrilamida pode ser ajustada quimicamente variando as concentrações de monômero e reticulador (Pelham e Wang, 1997). A poliacrilamida oferece várias vantagens adicionais sobre os substratos de silício. Ao longo de uma ampla gama de deformações, exibe um comportamento linearmente elástico. Além disso, a poliacrilamida não é tipicamente passível de ligação celular por conta própria, sem a conjugação de ligantes de adesão celular específicos (Nelson et al., 2003). Portanto, é um andaime perfeito para estudar a adesão e o comportamento celular de maneira controlável e definida.
o método computacional pelo qual as deformações no substrato são usadas para determinar as trações exercidas pela célula são muito semelhantes aos métodos usados nos substratos de silício estressados acima mencionados. No entanto, o uso de marcadores fluorescentes melhorou muito o método de rastreamento e a capacidade de calcular um campo de tensão preciso.Dembo e Wang publicaram vários estudos usando a técnica resultante, microscopia de força de tração, que elucida os mecanismos de migração de fibroblastos. Especificamente, eles mostraram que os lamellipodia da célula fornecem quase toda a força necessária para a locomoção para a frente (Munevar et al., 2001a). Seus resultados indicam que o lamelipódio é uma entidade mecânica distinta do resto do corpo celular. Curiosamente, essa mesma divisão mecânica dentro da célula não parece existir em células transformadas em H-ras, talvez explicando a diferença em seu comportamento móvel. Além disso, Beningo et al. (2001) investigou o papel das aderências focais na regulação da geração de tração e descobriu que o tamanho das aderências focais está inversamente relacionado à quantidade de força gerada. Além disso, a distribuição de aderências não corresponde bem à distribuição das forças de tração. Os autores concluem que esses resultados podem indicar que os complexos focais precoces são responsáveis por fortes forças propulsivas, e a maturação desses locais de adesão resulta em uma mudança em locais de ancoragem passiva — uma conclusão amplamente discutida na literatura. Além disso, Dembo e colegas de trabalho investigaram os papéis dinâmicos que as aderências frente versus traseira (Munevar et al., 2001B), myosin IIb (Lo et al., 2004), quinase de adesão focal (Wang et al., 2001), e canais Ca2+ ativados por estiramento desempenham na migração de fibroblastos (Munevar et al., 2004). Usando microscopia de força de tração, Dembo e colegas de trabalho fizeram progressos significativos na compreensão do papel da geração de força na migração de fibroblastos.
um dos avanços técnicos mais significativos usando gel de poliacrilamida é a capacidade de controlar de forma confiável a conformidade do substrato celular sem alterar a densidade do ECM. O ajuste da conformidade do substrato foi um ponto de viragem crítico no desenvolvimento da microscopia de força de tração, pois permitiu a investigação de quase qualquer tipo de célula e a compreensão do comportamento celular em função do ambiente mecânico. Antes do estudo de Pelham e Wang (1997), a maioria dos estudos que investigaram a migração e adesão celular se concentrou na migração celular em resposta ao seu ambiente químico solúvel (quimiotaxia) ou em resposta ao ligante conjugado ao substrato (haptotaxia). Além disso, estudos envolvendo o ambiente mecânico da célula focaram na resposta devido a forças impostas, como tensão de cisalhamento de fluidos e estiramento mecânico. No entanto, ao alterar a rigidez do substrato, Pelham e Wang (1997) criaram uma mudança significativa na maneira como os pesquisadores abordam a resposta celular e a mecanotransdução. Usando substratos de poliacrilamida, Pelham e Wang mantiveram a densidade ECM no substrato constante, alterando a conformidade mecânica. Eles demonstraram que os fibroblastos são capazes de responder ativamente à conformidade mecânica de seu substrato. As células em géis mais rígidos são mais disseminadas e migram mais lentamente do que as células em géis mais compatíveis. Além disso, a capacidade das células de sentir a conformidade mecânica de seu substrato é refletida em sua capacidade de alterar o estado de fosforilação de numerosas proteínas contidas na estrutura de adesão focal. As aderências focais em substratos rígidos são maiores, mais alongadas e mais estáveis, enquanto as aderências focais em substratos mais compatíveis contêm menos pp125FAK fosforilado e paxilina e aparecem muito mais irregularmente. Esses resultados foram os primeiros a sugerir que as pistas mecânicas de ECM podem ser tão importantes quanto as pistas químicas na regulação da adesão celular.
desde o artigo seminal de Pelham e Wang (1997), vários estudos investigaram os efeitos da complacência no comportamento celular. Lo et al. (2000) usaram a química da poliacrilamida para criar um substrato contendo uma etapa na rigidez — uma região central do substrato onde dois substratos de diferentes conformidades se encontram. Eles demonstraram um comportamento chamado durotaxia, pelo qual as células foram capazes de detectar e responder ativamente às mudanças na conformidade do substrato. As células que estavam migrando no substrato macio, ao atingir o limite da transição rígida–macia, cruzariam para o substrato rígido, enquanto as células em substratos rígidos exibiam trações mais altas e mais área de propagação e direções retraídas ou alteradas em resposta ao limite rígido–macio. Mais tarde, Wong et al. (2003) investigaram a capacidade dos fibroblastos de migrar em hidrogéis de poliacrilamida contendo gradientes de conformidade, em vez de uma etapa, como foi feito por Lo e colegas de trabalho. Eles descobriram que as células do músculo liso vascular tendem a migrar mais rápido em substratos mais macios do que em substratos mais rígidos (15 kPa vs 25 kPa), e que as células tendem a se acumular em substratos mais rígidos. Além disso, o padrão de migração em géis compatíveis com gradiente parecia ser direcionado para as regiões de gel mais rígidas, em vez de exibir o padrão de caminhada aleatória típico característico da migração celular. Engler et al. (2004) investigou ainda mais a resposta celular a géis compatíveis e mostrou que a resposta é em grande parte mediada pela Montagem do citoesqueleto de actina. Ao testar mudanças no citoesqueleto, Engler e colegas de trabalho foram capazes de mostrar que uma leve superexpressão da actina na célula pode compensar a perda de disseminação observada nas respostas de gel macio. Além disso, Yeung et al. (2005) mostraram que o limiar de sensibilidade para detecção de conformidade é específico do tipo de célula e que os contatos célula–célula também podem ajudar a resgatar as mudanças morfológicas observadas nos substratos moles para se assemelhar mais à morfologia das células em substratos mais rígidos (Yeung et al., 2005). No geral, o estudo da durotaxia ainda é relativamente jovem, e ainda há muito a ser aprendido sobre como uma célula detecta mecanicamente e responde às propriedades materiais de seu substrato e ambiente.
