Quinase Composição
Preparado por Swathi Arur
> Proteína-Quinase (soluções estoque de 1-10 mg/ml puro cinases) – para estes ensaios, eu uso purificada ERK2 quinase (NEB). Para cada enzima, é importante determinar o tampão ideal, a força iônica e o pH para a atividade. Se essas condições não foram estabelecidas, o protocolo listado abaixo pode ser usado como ponto de partida.
substrato (solução de estoque de 10 mM) – os substratos normalmente contêm uma serina /treonina em um motivo de local de fosforilação. Como controle eu uso a proteína básica de mielina (obtida de Sigma), que foi usada por NEB para calibrar a quinase ERK2.Além disso, os substratos devem ter uma carga líquida positiva para facilitar a ligação aos filtros de fosfocelulose utilizados no ensaio. Para ligação quantitativa ao papel de fosfocelulose, recomenda-se ter pelo menos 2 resíduos básicos e um terminal amino livre. Se um motivo do local de fosforilação não for conhecido, um substrato geral de tirosina quinase pode ser usado. Por exemplo, “proteína básica de mielina” (é um substrato não específico para muitos MAPKs). Para reações iniciais, uma concentração de substrato de 0,7-1,5 mM deve ser usada. Para determinar os parâmetros cinéticos para fosforilação do peptídeo sintético, é necessária uma gama de concentrações de peptídeo
10x tampão quinase-contém 5 mg/mL de BSA (para evitar a adsorção de quinase no tubo de ensaio), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (comprado de Upstate Biotech-magnésio / ATP Cocktail # 20-113) – uma solução de estoque de 1-5 mM é conveniente. Observe que a maioria dos MAPKs tem valores de Km Para ATP na faixa de 10-150 uM, portanto, para experimentos cinéticos, é importante usar concentrações saturadas de ATP para chegar a valores de Km e Vmax para os peptídeos.
ATP-10 mCi / mL.
ERK2 Quinase Ensaios
a) AUTORADIOGRAPHY ENSAIO:
- UM padrão quinase ensaio é realizado em um volume de 25 ul:
- 2.5 ul de 10X quinase buffer
- 5 ul de 1,0 mM de MgCl2 /ATP (0.2 mM de concentração final)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul de 10 mM (substrato 1.Concentração final de 2 mM)
- 1 U da quinase ERK2
- H2O a 25 ul
1. Antes dos experimentos, prepare um coquetel contendo buffer suficiente, ATP e ATP para completar os ensaios. Para ensaios em diferentes concentrações de substrato, o substrato deve ser diluído e adicionado separadamente a cada tubo. Depois de dispensar o coquetel em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, coloque os tubos em banho-maria a 30 graus C por 30 minutos. As reações devem ser iniciadas pela adição de quinase e podem prosseguir a 30 graus C.
2. Após o tempo desejado, termine as reações adicionando 2 x Tampão de amostra SDS e acabe em um gel.
3. Seque o gel em um papel Whatman 3.0 e exponha o gel seco a um autoradiograma e mantenha o cassete a-70cpor 2 horas. (para exposições mais longas, certifique-se de que o filme esteja seco novamente antes de colocar um novo autoradiograma nele).
B) análise cinética:
1. Conduza o ensaio da quinase como acima, desta vez use concentrações diferentes das carcaças que começam de 50nM a 1mM. Pare a reação após 30 minutos adicionando 45 ul de ácido tricloroacético 10% gelado (TCA) a cada reação. Vortex as reações.
3. Gire por 2 minutos em microcentrífuga (10k rpm).
4. Identifique 35 ul dos sobrenadantes em círculos de filtro de fosfato de celulose Whatman P81 de 2,1 cm de diâmetro.
6. Lave os círculos do filtro P81 três vezes com 500 ml de ácido fosfórico a 0,5% frio (5-10 minutos por lavagem). O progresso das etapas de lavagem pode ser seguido removendo o círculo do filtro P81 para uma reação em branco e verificando-o com um contador Geiger.
7. Lave uma vez com 200 ml de acetona à temperatura ambiente por 5 minutos.
8. Deixe os círculos do filtro secarem à temperatura ambiente.
9. Coloque círculos de filtro em frascos de cintilação e meça a incorporação de 32P contando as almofadas secas em um contador de cintilação. A atividade específica do ATP em uma reação de quinase (por exemplo, em cpm / pmol) pode ser determinada detectando uma pequena amostra (2-5 ul) da reação em um círculo de filtro P81 e contando diretamente (sem lavagem). As contagens por minuto obtidas na reação quinase (menos em branco) são então divididas pela atividade específica para determinar os moles de fosfato transferidos na reação.
cinética da fosforilação do substrato
os parâmetros cinéticos para fosforilação de um substrato por um MAPK podem ser determinados usando uma variação no protocolo acima.
1. Realize uma reação a uma alta concentração de substrato para estabelecer que a proteína é um substrato.
2. Varie a concentração da enzima no ensaio. A taxa de fosforilação do substrato deve ser proporcional à concentração da enzima nas condições do ensaio. Este experimento também é usado para determinar a quantidade de enzima necessária para os estudos cinéticos.
para determinar as taxas, um curso de tempo de fosforilação do substrato deve ser realizado. Neste caso, prepare uma reação enzimática maior (usamos 150 ul). Nos pontos de tempo desejados, retire 25 alíquotas ul e transfira-as para tubos de microcentrífuga contendo 45 ul de TCA 10% gelado e analise as reações conforme descrito acima. A fosforilação do substrato deve ser linear com o tempo e, para medição de constantes cinéticas, as taxas iniciais de reação (5%) devem ser usadas.
3. Varie a concentração do substrato no ensaio. Use um gráfico de velocidade vs. concentração de peptídeo para obter uma estimativa inicial do valor de Km. Uma vasta gama de concentrações da carcaça (por exemplo, 20 uM a 2 milímetros) deve ser usada nesta medida inicial.
4. Para determinar Km (substrato) e Vmax , varie a concentração do substrato e meça a taxa de transferência de fosfato. Uma boa gama de concentrações de substrato são os seguintes Múltiplos De Km: 0,125 X Km, 0,25 x Km, 0,5 X Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. As reações devem ser realizadas em triplicado para melhores resultados.
5. As constantes cinéticas são determinadas por mínimos quadrados não lineares ponderados adequados à velocidade hiperbólica vs. parcelas usando programas iterativos, como NFIT (Island Products, Galveston, TX).
cálculo de RAR:
RAR: razão Aceitadora relativa = Vmax / Km definida como uma medida geral da capacidade de uma proteína funcionar como substrato.
normalizo o RAR de um determinado substrato com proteína básica de mielina, ou seja, calcule o valor de RAR Para cada substrato e divida-o pelo valor de RAR da proteína básica de mielina (definindo assim MBP em 1,0).
