1. Teste de mutação Kras exon 2 (códons 12/13) e exon 3 (códon 61): teste de mutação Cobas® KRAS para uso em Diagnóstico In Vitro (Roche).
o teste de mutação Cobas® Kras é um teste de PCR em tempo real para a detecção qualitativa de mutações somáticas no exon 2 (códons 12/13) e exon 3 (códon 61) do gene KRAS usando uma entrada de DNA de 100 ng. O teste pode detectar 19 mutações KRAS. A presença de mutações é detectada com uma especificidade analítica de pelo menos 99% e um limite de detecção de pelo menos 5% de nível mutante em um fundo de DNA genômico de tipo selvagem.
o teste de mutação Cobas® KRAS é baseado em dois processos principais: (1) preparação manual da amostra para obter DNA genômico de uma ou duas seções de espessura de 5 µm de tecido FFPE CRC contendo pelo menos 10% de células tumorais; (2) amplificação por PCR do DNA alvo usando pares de primer complementares e duas sondas de oligonucleotídeo rotuladas com corante fluorescente. Os pares de iniciadores usados definem uma sequência de 85 pares de bases para o exon 2 contendo os códons KRAS 12 e 13, e uma sequência de 75 pares de bases para o exon 3 contendo o códon KRAS 61 no DNA genômico humano. Uma ponta de prova é projetada detectar a sequência do códon 12/13 de KRAS no exão 2, e a outra ponta de prova é projetada detectar a sequência do códon 61 de KRAS no exão 3 do gene de KRAS. A detecção da mutação é conseguida derretendo a análise da curva pelo analisador de Cobas z 480 (1).
2. KRAS Teste de Mutação v2 (LSR)
KRAS Teste de Mutação v2 (LSR) é um alelo-específicos, em tempo real teste de PCR para a detecção qualitativa e identificação do éxon 2, 3, e 4 mutações no V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homóloga (KRAS) do gene da fixadas em formol, incluídas em parafina tecido (FFPET). O teste foi projetado para detectar 28 mutações únicas. A presença de mutações é detectada com uma especificidade analítica de pelo menos 99% e um limite de detecção de pelo menos 1% de nível mutante em um fundo de DNA genômico de tipo selvagem.
o teste de mutação KRAS v2 (LSR) é baseado em dois processos: (1) preparação manual da amostra para obter DNA genômico do FFPET; e (2) amplificação e detecção de PCR do DNA alvo usando pares de iniciadores complementares e sondas de oligonucleotídeo rotuladas com corantes fluorescentes.
o teste de mutação KRAS v2 (LSR) usa primers que definem sequências específicas de pares de bases para cada uma das mutações direcionadas. A amplificação ocorre apenas nas regiões do gene KRAS entre os primers; todo o gene não é amplificado. As sequências Kras direcionadas variam de 79 a 114 pares de bases. A detecção da mutação é conseguida com a análise do PCR com o analisador de Cobas z 480. (1)
3. BRAF/ARN Teste de Mutação (LSR)
O BRAF/ARN Teste de Mutação (LSR) é um alelo-específicos, em tempo real teste de PCR para a detecção qualitativa e identificação do éxon 11 e 15 de mutações no proto-oncogene B-Raf (BRAF) gene e o éxon 2, 3, e 4 mutações no neuroblastoma, o RAS viral oncogene homóloga (ARN) do gene da fixadas em formol, incluídas em parafina tecido (FFPET).
o teste foi projetado para detectar 36 mutações únicas. A presença de mutações é detectada com uma especificidade analítica de pelo menos 99% e um limite de detecção de pelo menos 5% de nível mutante em um fundo de DNA genômico de tipo selvagem.
o teste de mutação BRAF/NRAS (LSR) é baseado em dois processos principais: (1) preparação manual da amostra para obter DNA genômico do FFPET; e (2) amplificação e detecção de PCR do DNA alvo usando pares de primer complementares e sondas de oligonucleotídeo rotuladas com corantes fluorescentes.
o teste de mutação BRAF/NRAS (LSR) usa primers que definem sequências específicas de pares de bases para cada uma das mutações direcionadas. A amplificação ocorre apenas nas regiões dos genes BRAF ou NRAS entre os primers; todo o gene não é amplificado. As sequências BRAF variam de 101 a 120 pares de bases. As sequências NRAS variam de 94 a 121 pares de bases. A detecção da mutação é conseguida com a análise do PCR com o analisador de Cobas z 480. (2)
implicação Clínica
KRAS e ARN estão intimamente relacionadas com o oncogene RAS membros da família, e mutações no gene em códons 12, 13 (éxon 2), 61 códons (éxon 3) e codão 146 (éxon 4) resultar em níveis aumentados de guanosina trifosfato ligados a proteínas RAS. A sinalização hiperativa do RAS promove a oncogênese. No carcinoma colorretal (CRC), as mutações KRAS e NRAS nesses códons são encontradas em até 50% dos casos e prevêem uma falta de resposta à terapia anti-EGFR. A maioria das mutações RAS são mutações pontuais que ocorrem no exão 2 de KRAS (códons 12 ou 13; cerca de 40%). Outras mutações Ras são menos frequentes, com as mutações mais comuns ocorrendo em Kras exons 3 e 4 e NRAS exons 2 e 3 (3).
cerca de 50% dos melanomas abrigam mutações ativadoras no BRAF. Mais de 90% das mutações BRAF resultam em um nucleotídeo 1799 T>uma mudança que leva a uma substituição de ácido valina para glutâmico na posição 600 (V600E). A mutação BRAF V600E causa sinalização descontrolada da via MAPK, levando ao crescimento e proliferação celular excessivos. Os agentes que visam BRAF mutante ativado (inibidores BRAF) provaram ser bem-sucedidos em pacientes com melanoma metastático que abrigam essa mutação (1-3).
além de seu valor preditivo no melanoma, a mutação BRAF V600E também tem valor prognóstico no câncer colorretal e no câncer de pulmão (NSCLC) (4,5,7). A mutação BRAF V600E é encontrada em cerca de 10% do carcinoma colorretal metastático e tem sido associada à presença de instabilidade de microssatélites (6). No geral, pacientes com CRC mutante BRAF têm baixas taxas de resposta a terapias convencionais e prognóstico adverso. Embora os melanomas com mutação BRAF V600 sejam sensíveis aos inibidores BRAF, os CRCs com mutação BRAF V600 podem não ser tão sensíveis. A ativação do EGFR no câncer colorretal pode explicar por que os cânceres colorretais geralmente têm uma resposta menor aos inibidores da BRAF. Portanto, é aconselhável iniciar a terapia combinada com inibidores de EGFR e BRAF.
a mutação BRAF V600E também é encontrada em 3-5% de todos os cânceres de pulmão (7). Enquanto BRAF-inibidores têm provado ser bem sucedido em mutação V600E-positivo NSCLC pacientes, o FDA aprovou o uso da terapia de combinação com BRAF – e MEK-inibidor para NSCLC pacientes com uma mutação V600E com base nos resultados de um programa internacional, multicêntrico, de três de coorte, não-randomizado, não-comparativo, open-label, julgamento em pacientes com localmente confirmou BRAF V600E mutação-positivo metastático NSCLC.
requisitos da amostra
os espécimes aceitáveis para o ensaio são amostras de tecido de carcinoma colorretal com fixação de formalina, embutidas em parafina, com um tempo de fixação de 6-48 horas.
volume
1 bloco de parafina representativo é preferido. Alternativamente, para amostras de ressecção, é necessário um mínimo de 5 seções de tecido não manchadas (5 µm de espessura) (teste completo de RAS).
Instruções de armazenamento e expedição
manter e enviar amostras à temperatura ambiente.
limitações
o conteúdo insuficiente do tumor pode não permitir a detecção de mutações KRAS/NRAS/BRAF: é necessário 10% das células tumorais. O conteúdo do Tumor é avaliado antes da análise e a macrodissecção é realizada. Fixadores que não sejam formalina ou tempo de fixação prolongado podem dar origem a resultados inadequados.
requisitos Especiais
Nenhum.
tempo de rotação
5 a 7 dias úteis para lâminas e blocos de parafina respectivamente.
- Li et al. Um ensaio altamente verificado para detecção de mutação KRAS em tecido e Plasma de câncer de pulmão, colorretal e pancreático. Arch Pathol Lab Med. 2019 Fev;143:183-9
- Patten et al. Um teste sensível e preciso para detecção simultânea de 36 mutações BRAF e NRAS. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Marques de Oliveira et al. Tratamento com Panitumumab-FOLFOX4 e mutações RAS no câncer colorretal. N Engl J Med. 2013 Sep 12; 369(11):1023-34.
atualizado em 03 Dezembro 2019
