- rezumat
- 1. Introducere
- 2. Materiale și reactivi
- 2.1. Izolarea și cultivarea celulelor epiteliale Limbale umane
- 2.2. Testul de eficiență a formării coloniilor (CFE)
- 2.3. Testul de dublare a populației celulare
- 2.4. Extracția ARN și reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real
- 2.5. Colorarea imunofluorescentă
- 2.6. Analiza Western Blot
- 2.7. Statistici
- 3. Rezultate
- 3.1. Fenotipul celulelor Stem epiteliale corneene în mediul SR
- 3.2. Testul CFE
- 3.3. PCR și analiza PCR în timp Real
- 3.4. Colorarea imunofluorescentă
- 3.5. Western Blot
- 4. Discuție
- interese concurente
- mulțumiri
rezumat
celulele epiteliale limbale pot fi menținute pe stratul de alimentare 3T3 cu mediu de cultură suplimentat cu ser fetal bovin, iar aceste celule au fost utilizate pentru tratarea cu succes a deficitului de celule stem limbale. Cu toate acestea, serul fetal bovin conține componente necunoscute și prezintă variații cantitative și calitative lot-la-lot. Pentru a îmbunătăți starea culturii, s-a investigat înlocuirea serului KnockOut definit pentru a înlocui serul fetal bovin pentru cultivarea celulei epiteliale limbale umane. Celulele epiteliale primare ale limbului uman au fost cultivate în ser KnockOut și, respectiv, în mediu suplimentat cu ser fetal bovin. Rata de creștere a celulelor, expresia genelor și menținerea celulelor stem epiteliale limbale au fost studiate și comparate între aceste două grupuri. Celulele epiteliale primare ale limbului uman au fost izolate și cultivate cu succes în serie în acest nou mediu suplimentat cu ser KnockOut; proliferarea celulelor și menținerea celulelor stem au fost similare cu cele ale celulelor crescute în mediul suplimentat cu ser fetal bovin. Aceste date sugerează că acest mediu suplimentat cu ser KnockOut este un înlocuitor eficient pentru mediul tradițional suplimentat cu ser fetal bovin pentru cultura celulelor epiteliale limbale, iar acest mediu are un potențial mare pentru menținerea pe termen lung a celulelor epiteliale limbale, transplantul de celule stem epiteliale limbale și regenerarea țesuturilor.
1. Introducere
celulele stem epiteliale corneene sunt localizate în stratul bazal al limbului, o structură ondulată și pigmentată numită palisadele Vogt . Aceste celule stem susțin reînnoirea continuă a epiteliului cornean pe parcursul unei vieți și înlocuiesc celulele epiteliale corneene rănite sau pierdute . Deficitul de celule stem limbale (LSCD) și bolile asociate suprafeței oculare pot fi tratate cu succes folosind autogrefa epitelială limbală cultivată . Succesul acestor tratamente chirurgicale depinde de extinderea eficientă a celulelor stem epiteliale limbale care au implicat stratul de alimentare 3T3 și serul fetal bovin (FBS) în majoritatea cazurilor. Sistemul de cultură a stratului de alimentare 3T3 a fost creat de Rheinwald și Green și a fost utilizat cu succes pentru a extinde celulele epiteliale din pielea umană, foliculul de păr, limbus, conjunctiva și țesutul mucoasei orale . Cu toate acestea, FBS nu este bine definit și afișează întotdeauna variații cantitative și calitative de la lot la lot . FBS conține, de asemenea, componente xenogene potențial dăunătoare, care pot stimula reacțiile imunologice și pot transmite boli animale și agenți patogeni . Cu toate aceste preocupări, există o nevoie din ce în ce mai mare de a dezvolta un mediu de cultură bine definit pentru a înlocui mediul tradițional suplimentat de FBS.
în prezent există anumite medii alternative fără ser pentru creșterea celulelor epiteliale, cum ar fi mediul definit fără ser de keratinocite (KSFM XV, Invitrogen, SUA), mediul de creștere a keratinocitelor (kgm XV, Clontech, SUA), Epilife XV (Invitrogen, SUA) și mediile țintă ale celulelor progenitoare (PCT) (Cellntec XV, Elveția). S-a demonstrat că aceste produse susțin expansiunea celulelor epiteliale corneene. Cu toate acestea, ei încă mai au nevoie de suplimente de produse nedefinite, cum ar fi extractul hipofizar bovin (BPE) sau albumina serică umană (HAS). Și majoritatea acestor medii necesită o densitate mare de însămânțare a celulelor, ceea ce poate să nu fie practic pentru extinderea celulelor epiteliale corneene umane. Mai mult, celulele stem epiteliale corneene, care sunt detectate ca holoclone în sistemul de cultură 3T3, nu au putut fi menținute în acest mediu de cultură fără ser pe termen lung . Până în prezent, nu există un mediu definit fără ser care ar putea susține expansiunea celulelor stem epiteliale corneene pe termen lung.
înlocuirea serului KnockOut (SR) este o formulare definită fără ser, care a fost concepută pentru a înlocui direct FBS pentru întreținerea celulelor stem embrionare (Esc) și a celulelor stem pluripotente induse (IPSC). S-a demonstrat că KnockOut SR oferă condiții de creștere consistente pentru celulele ES și cultura iPSC, iar celulele ES cultivate în mediul suplimentat cu KnockOut SR sunt substanțial mai puțin diferențiate decât cele cultivate în mediul suplimentat cu FBS, iar transmiterea liniei germinale nu este cel puțin compromisă. Având în vedere asemănările în metodele de cultură ale celulelor epiteliale și celulelor ES și având în vedere faptul că knockout SR înlocuiește FBS în cultura celulelor ES, aici se presupune că knockout SR ar putea fi utilizat pentru a înlocui FBS în cultura celulelor epiteliale limbale.
2. Materiale și reactivi
vase de cultură celulară, baloane, tuburi de centrifugă și pipete serologice au fost achiziționate de la Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco ‘S Modified Eagle’ s Medium( DMEM), Ham ‘ s F-12, HEPES, penicilină și streptomicină, L-glutamină, 0,05% tripsină-0.02% EDTA solution, Superscript III kit, și rneasy kit-ul au fost achiziționate de la Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Fibroblastele NIH 3T3 de șoarece (ATCC CCL 92) au fost obținute din colecția de cultură de tip american (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II era din Roche. Anticorpii monoclonali (mAb) împotriva ABCG2 (clona BXP-21) și connexin 43 provin de la Millipore; p63 (clona 4A4), K5 și K19 provin de la Santa Cruz; K3 mAb (clona AE5) provin de la ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-anticorp secundar conjugat anti-șoarece de capră a fost de la Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Geneamp ARN-PCR și Taqman universal PCR Master Mix Amperază UNG kiturile au fost de la Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomicina C, insulina bovină, transferina umană, hidrocortizonul, factorul de creștere epidermică umană (EGF), toxina holerică și alți reactivi provin de la Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Izolarea și cultivarea celulelor epiteliale Limbale umane
inelele corneei-limbale au fost recoltate de la cinci donatori sănătoși imediat după transplantul de cornee, a fost solicitat consimțământul informat și protocolul de recoltare a probelor a fost aprobat de Consiliul de evaluare instituțională (IRB) al Universității Jilin. Inelele corneene-limbale proaspete au fost tratate cu 0,25% Dispază II la 4% C peste noapte, iar stratul epitelial a fost curățat din țesutul stroma subiacent și tratat cu 0,05% tripsină-0,02% EDTA la 37% C timp de 15 minute. Activitatea tripsinei a fost neutralizată cu 10% FBS și celulele epiteliale limbale disociate au fost colectate și centrifugate la 1.500 rpm Timp de 5 minute. Viabilitatea celulelor epiteliale a fost determinată de albastru trypan, excluzând colorarea, iar numărul celulelor a fost calculat folosind hemocitometru.
fibroblastele de șoarece 3T3 au fost menținute în mediul Eagle modificat al Dulbecco (DMEM, glucoză ridicată) suplimentat cu 10% FBS, L-glutamină (2 mM) și penicilină-streptomicină (50 UI/mL) și cultivat cu 5% CO2 și atmosferă umidificată. Celulele 3T3 au fost subculturate la fiecare 6 zile când au atins confluența de 80-90%. Celulele 3T3 au fost menținute în serie și numai celulele înainte de trecerea 20 au fost utilizate pentru prepararea stratului de alimentare. Pentru a pregăti stratul de alimentare, celulele confluente 3T3 au fost tratate cu mitomicină C (10%/ml) timp de 2 ore la 37% C, spălate cu PBS de două ori și tratate cu 0,05% tripsină timp de 5 minute la 37% C. fibroblastele 3T3 au fost apoi colectate și placate la o densitate de 30.000 celule/cm2 cu o zi înainte de însămânțarea celulelor epiteliale.
celulele epiteliale limbale umane au fost cultivate pe stratul de alimentare 3T3 folosind fie mediu FAD, fie mediu de înlocuire serică (SR). Mediul FAD este un amestec de mediu DMEM și Ham ‘ s f-12 (1 : 1) care conține 10% ser fetal bovin, L-glutamină (2 mM) și penicilină-streptomicină (50 UI/mL), factor de creștere epidermică (10 ng/mL), insulină (5 hectog/mL), adenină (0,18 mM), hidrocortizon (0,4 hectog/mL), toxină de holeră (0,1 nM) și triiodotironină (2 nM). Mediul SR este un amestec de DMEM și mediul F-12 al lui Ham (1 : 1) care conține 10% înlocuire serică SR KnockOut, L-glutamină (2 mM) și penicilină-streptomicină (50 UI/mL), factor de creștere epidermică (10 ng/mL), insulină (5 hectogg/mL), adenină (0,18 mM), hidrocortizon (0.4 hectog/mL), toxină holerică (0,1 nM), triiodotironină (2 nM), transferină (5 hectog/mL) și seleniu (5 ng/mL). Celulele epiteliale limbale au fost însămânțate pe stratul de alimentare 3T3 la o densitate de 6.000 celule/cm2 și cultivate cu 5% CO2 și atmosferă umidificată. Mediul FAD a fost schimbat la fiecare 3 zile, în timp ce mediul SR a fost schimbat la fiecare 2 zile.
2.2. Testul de eficiență a formării coloniilor (CFE)
pentru testul CFE, 200 de celule epiteliale limbale umane din cultura FAD sau cultura SR au fost placate pe un vas petri de 100 mm care conține strat de alimentare 3T3 tratat cu mitomicină C și cultivate conform descrierii de mai sus. După cultura de 12 zile, vasele au fost fixate cu 10% formalină timp de 30 de minute la temperatura camerei și colorate cu 1% Rodamină B timp de încă 30 de minute. După spălarea cu apă distilată, numerele coloniilor au fost numărate și analizate. Eficiența formării coloniilor a fost exprimată ca numărul de colonii formate împărțit la 200.
2.3. Testul de dublare a populației celulare
celulele epiteliale Limbale au fost menținute pe stratul de alimentare 3T3 tratat cu mitomicină C folosind mediu FAD sau mediu SR. Celulele epiteliale au fost tripsinizate la atingerea confluenței de 80-90% și pasate la o densitate de 6.000 de celule/cm2. Culturile au fost menținute în serie pentru 10 pasaje. La fiecare pasaj, celulele epiteliale limbale au fost recoltate și numărul de celule a fost numărat. Numărul de dublări ale populației (PD) pentru fiecare pasaj a fost calculat conform următoarei formule: , unde reprezintă numărul total de celule obținute la fiecare pasaj și reprezintă numărul de celule de placare la început.
2.4. Extracția ARN și reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real
pentru a evalua nivelul de expresie a genelor celulelor epiteliale limbale, s-au efectuat PCR și PCR în timp real. ARN-ul Total a fost extras din celulele epiteliale corneene folosind kitul RNeasy urmând instrucțiunile producătorului. ARN-ul a fost cuantificat prin absorbția sa la 260 nm și stocat la -80 C. Pentru a sintetiza ADNc – urile, s-a utilizat 1 hectar de ARN total cu trusa de transcriere inversă Superscript III. PCR a fost realizat folosind Platinum PCR master mix( tehnologia vieții); iar PCR în timp real a fost realizat folosind SYBR Green PCR Master Mix (Roche) cu primerii descriși anterior . Reacțiile PCR în timp real s-au efectuat în trei exemplare, cu o etapă inițială de activare la 95% C timp de 3 minute, urmată de 45 de cicluri: 95% C timp de 30 de secunde, 60% C timp de 30 de secunde și 72% C timp de 40 de secunde. Expresia relativă a genelor a fost calculată prin normalizarea diferenței de valoare a pragului ciclului (delta Ct), valori ale genelor la valoarea delta Ct a gliceraldehidelor-3-fosfat dehidrogenazei (GAPDH).
2.5. Colorarea imunofluorescentă
celulele epiteliale limbale umane au fost însămânțate în lamele de cultură cu strat de alimentare 3T3 în mediu FAD sau mediu SR. La trei zile după însămânțare, culturile au fost fixate cu paraformaldehidă 4% sau acetonă rece la 4 centimetric C timp de 10 minute. După spălarea cu PBS de două ori, celulele au fost blocate cu 5% ser de capră în PBS timp de 30 de minute. Anticorpii primari de șoarece împotriva p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) și connexin 43 (1: 1000, Millipore) au fost Aplicați și incubați peste noapte la 4 C. anticorpul secundar conjugat Alexa Fluor 568 a fost aplicat timp de 1 oră după spălarea cu PBS de două ori. Nucleele celulare au fost apoi contracarate cu Hoechst 33342 (1 hectog / mL în PBS) timp de 20 de minute. După spălarea cu PBS de 3 ori, cultura celulară a fost montată cu mediu de montare (Vector Laboratories, Burlingame, CA) și examinată sub microscop fluorescent (BX50; Olympus, Tokyo, Japonia).
2.6. Analiza Western Blot
celulele epiteliale Limbale cultivate au fost lizate cu tampon RIPA (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM Naci, 1% deoxicolat de sodiu, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA și cocktail inhibitor de protează; Roche Diagnostics) pe gheață timp de 30 de minute. Concentrația proteinei a fost cuantificată utilizând testul proteinei acidului bicinconinic (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Lizații celulari totali (40%) au fost electroforizați în gel SDS-PAGE cu gradient de 12%, transferați în membrana de nitroceluloză (Bio-Rad), blocați cu lapte degresat 5% în soluție salină tamponată Tris (TBS) timp de 1 oră și probați cu anticorpi de șoarece împotriva proliferării antigenului nucleului celular (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) sau p63 (4A4, Santa Cruz, CA) peste noapte la 4 de trei ori cu TBS, incubat cu IgG anti-șoarece de capră (1 : 5000, conjugat cu HRP, Santa Cruz, CA) sau IgG anti-capră de iepure (1 : 5000, HRP-conjugat, Santa Cruz, CA) timp de 1 oră la temperatura camerei și dezvoltat cu substraturi chemiluminescente îmbunătățite (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Nivelurile de Expresie ale ABCG2, PCNA și p63 au fost măsurate folosind măsurarea intensității semicantitative și normalizate la nivelul GAPDH care a servit drept control intern.
2.7. Statistici
Rezumatul datelor CFE și ori relativă a PCR în timp real a fost raportat ca mijloc SD și a comparat cu ajutorul student nepereche-test cu Microsoft Excel (2003/XP versiune). Rezultatele testelor au fost raportate ca valori cu două cozi, unde au fost considerate semnificative statistic.
3. Rezultate
3.1. Fenotipul celulelor Stem epiteliale corneene în mediul SR
un total de 5 țesuturi inelare corneene-limbale au fost recoltate de la donatori în intervalul de vârstă 32-65 ani. Aceste țesuturi au fost conservate și prelucrate în 24 de ore de la recoltare. Cultura de celule epiteliale corneene primare umane a fost stabilită cu succes în mediul FAD [Figurile 1 (a) și 1(b)] și în mediul SR [Figurile 1(c) și 1 (d)]. Celulele epiteliale corneene menținute în stratul de alimentare SR mediu + 3T3 au prezentat o morfologie cu dimensiuni mici și un raport ridicat de nuclee/citoplasmă, care a fost o morfologie tipică a celulelor epiteliale nediferențiate, iar celulele scuamoase plate diferențiate mari au fost rareori observate (Figura 1(c)). Celulele epiteliale menținute în mediul SR au început să formeze colonii la 3 zile după însămânțare (Figura 1(c)). Dimensiunile acestor colonii au fost similare cu cele formate în stratul de alimentare Mediu FAD + 3T3(Figura 1 (A)), dar aceste colonii au fost mai puțin compactate decât cele din stratul de alimentare FAD + 3T3. În decurs de 7 zile, celulele epiteliale au atins confluența în mediul SR cu dimensiuni mici uniforme (Figura 1(d)), care a fost observată și în cultura FAD (Figura 1(b)). În acest studiu, celulele epiteliale corneene umane ar putea fi derivate și menținute în stratul de alimentare SR mediu + 3T3 pentru toți cei cinci donatori. Pentru cultivarea pe termen lung, celulele epiteliale corneene umane au fost subculturate în serie în stratul de alimentare SR mediu + 3T3 pentru mai mult de 10 pasaje (). În timpul fiecărui pasaj, celulele au fost tripsinizate și colectate atunci când celulele au atins confluența de 80-90%; numerele de celule au fost calculate pentru testul de dublare a populației. Rezultatul arată că randamentul celulelor epiteliale din mediul SR este apropiat de cel al celulelor cultivate în mediul FAD, așa cum se arată în Figura 2(A), iar aceste date sunt similare cu rapoartele anterioare . În rezumat, datele prezentate aici arată că mediul de cultură SR + stratul de alimentare 3T3 tratat cu mitomicină C susține creșterea și proliferarea clonală a celulelor epiteliale corneene umane.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Testul CFE
în continuare am examinat și comparat CFE a celulelor epiteliale corneene cultivate în medii FAD și SR. Pentru a analiza CFE, celulele epiteliale corneene cultivate în medii SR și FAD au fost recoltate și însămânțate la o densitate de 200 de celule pe vas petri de 100 mm, care a fost preseeded cu strat de alimentare 3T3 tratat cu mitomicină C, iar această cultură a fost lăsată să crească timp de 12 zile. Celulele epiteliale corneene au început să formeze colonii la 5-7 zile după inițierea culturii. După cum se arată în Figura 2(b), după cultură timp de 12 zile, celulele epiteliale corneene menținute în mediu SR au prezentat CFE și dimensiuni ale coloniei similare în comparație cu celulele menținute în mediu FAD. Valoarea CFE pentru celulele epiteliale în mediile SR și FAD a fost și, respectiv (Figura 2 (c)). Analiza statistică a demonstrat că nu au existat diferențe semnificative în eficiența formării coloniilor () și suprafața medie a coloniilor () între mediile SR și FAD(Figura 2 (c)). Am cuantificat procentul tipurilor de colonii în funcție de suprafața coloniilor. Rezultatele au arătat că procentul de colonii abortive (suprafața coloniei <1 mm2) formate în mediul SR a fost similar cu cel din mediul FAD (). În mod similar, procentul coloniilor mari (suprafața coloniei >4 mm2) formate în mediul SR a fost apropiat de cel din mediul FAD () (Figura 2 (d)). Aceste rezultate indică faptul că celulele epiteliale corneene cultivate în mediu SR posedă un grad similar mai mare de potențial proliferativ în comparație cu celulele cultivate în mediu FAD.
3.3. PCR și analiza PCR în timp Real
pentru a studia expresia genelor, PCR și PCR în timp real au fost efectuate pe celule epiteliale cultivate atât în mediile FAD, cât și în mediile SR. Gena de menaj GAPDH a fost folosită ca control intern. Datele PCR arată că celula cultivată atât în mediul FAD, cât și în mediul SR prezintă o expresie de transcriere la nivel înalt a PCNA marker proliferativ. Celulele din ambele medii prezintă o expresie pozitivă a citokeratinei 3 și a citokeratinei 12, care este în concordanță cu originea lor limbus. Expresia pozitivă a markerului celulelor epiteliale bazale, citokeratina 15, a fost observată și în ambele culturi. Expresia ABCG2 și Xvnp63 a fost detectată în ambele culturi, deși expresia ABCG2 a scăzut ușor după cultura primară în mediul SR. Nivelul scăzut al expresiei conexinei 43 a fost observat în ambele culturi și nivelul scăzut implicit al diferențierii celulelor epiteliale în ambele medii. Pentru PCR în timp real, analiza cantitativă a nivelului ARNm a arătat că nu a existat o diferență semnificativă de expresie () a p63 și ABCG2 între celulele epiteliale crescute în medii FAD și SR (Figura 4(a)). De asemenea, a fost efectuată analiza în timp real a markerului de diferențiere epitelială corneană citokeratină 3 și citokeratină 12. Ambii acești doi markeri au fost abia detectabili atât în culturile de celule FAD, cât și în cele de celule SR și, surprinzător, nu există nicio diferență semnificativă () în nivelul de expresie între aceste două culturi.
3.4. Colorarea imunofluorescentă
pentru a confirma că celulele epiteliale crescute în mediul SR au menținut stemul și starea nediferențiată, s-a efectuat colorarea imunofluorescentă a mai multor markeri de proliferare, diferențiere și celule stem epiteliale presupuse. După cum se arată în Figura 4, în mediul SR, majoritatea celulelor epiteliale au prezentat o morfologie mică și uniformă, iar majoritatea celulelor au fost puternic colorate cu P63, presupusul marker de celule stem epiteliale. ABCG2 celule colorate pozitive au fost, de asemenea, observate într-o distribuție neuniformă în coloniile de celule epiteliale limbale. Celulele menținute în mediul SR au fost slab colorate pentru connexin 43 și citokeratină 3. Expresia scăzută a acestor doi markeri de diferențiere sugerează un nivel scăzut de diferențiere a celulelor epiteliale în cultura celulară. Stilul de colorare similar a fost observat și în celulele menținute cu mediu FAD (Figura 4(b)). Aceste date implică faptul că celulele epiteliale limbale umane cultivate în mediul SR au menținut expresia la nivel înalt a markerilor celulelor stem epiteliale presupuse, exprimând în același timp un nivel scăzut al markerilor de diferențiere.
3.5. Western Blot
pentru a confirma dublu expresia cantitativă a genei și rezultatele colorării imunofluorescente, expresia markerilor potențiali ai celulelor stem epiteliale (p63 și ABCG2) și a markerului de proliferare (PCNA) a fost evaluată folosind western blot. Folosind anticorpul monoclonal p63 (clona 4A4, Santa Cruz), proteina p63 (70 KD, izoforma de la centimetrii de la centimetrii) a fost detectată la un nivel ridicat de Expresie în mediul SR. Expresia ABCG2 (70 KD) a fost detectată în fiecare pasaj de celule cultivate în mediu SR. PCNA, marker de proliferare, a fost, de asemenea, detectat în celulele cultivate în mediu SR (Figura 3(c)). Iar nivelurile de Expresie ale p63, ABCG2 și PCNA au fost similare în 10 pasaje cu măsurarea intensității semicantitative (Figura 3(d)) folosind GAPDH ca control intern.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Discuție
celulele epiteliale cultivate pe stratul de alimentare 3T3 au fost derivate cu succes și utilizate pentru tratamentul diferitelor situații clinice, cum ar fi arsuri severe, ulcere ale piciorului diabetic, defecte ale pielii și defecte ale mucoasei orale . Primul transplant de celule stem epiteliale limbale a fost descris în 1997 de Pellegrini și colab. . În ultimele decenii, au fost dezvoltate mai multe metode de cultură diferite , inclusiv cultura celulelor epiteliale limbale pe membrana amniotică umană (HAM) cu sau fără strat de alimentare 3T3 , cultura celulelor epiteliale pe plăci sensibile la temperatură și cultura celulelor epiteliale cu mediu comercial de cultură fără ser. Deoarece raportul recent indică faptul că rezultatul clinic al transplantului de celule epiteliale ale corneei/limbului depinde de faptul dacă celulele stem ale limbului sunt conservate în cultura celulară, s-a subliniat că holoclonele au fost reținute numai în sistemul de cultură FAD + 3T3 . Deoarece acest protocol de cultură implică utilizarea FBS, există îngrijorări din ce în ce mai mari privind siguranța că FBS este un produs de origine animală slab definit și are potențialul de a transmite pacienților boli derivate din animale . Prin urmare, există o nevoie tot mai mare de a dezvolta mediu de cultură fără produse de origine animală și fără FBS pentru a înlocui mediul tradițional FAD .
în acest studiu, am dezvoltat un nou mediu de cultură fără ser, în care KnockOut SR a înlocuit FBS. Fenotipurile celulelor stem epiteliale limbale din acest nou mediu de cultură fără ser au fost evaluate prin imunosupresie cu anticorpi pentru markerii de celule stem propuși (p63, ABCG2) și markerii de diferențiere (citokeratină 3, connexină 43).
factorul de transcriere nucleară p63 a fost propus anterior a fi un marker al celulelor stem epiteliale, iar in aceste celule s-a propus ca fiind izoforma predominantă a izoformelor p63 . Rezultatele noastre sunt în concordanță cu aceste rapoarte anterioare; P63 nuclear a fost puternic exprimat în cultura celulară limbală, care a fost demonstrată prin imunostimulare, PCR în timp real și Western blot. Prezența p63 în culturile celulare limbale indică potențialul lor proliferativ ridicat și de auto-reînnoire. ABCG2, un membru al transportorilor casetei de legare ATP (ABC), cunoscut inițial sub numele de proteina 1 rezistentă la cancerul de sân (BCRP1), a fost propus ca un alt marker presupus de celule stem pentru celulele stem adulte, inclusiv celulele stem epiteliale limbus . Expresia ridicată a ABCG2 în mediul SR a fost evidențiată prin imunostimularea și PCR în timp real.
K3 și K12 sunt bine cunoscuți ca markeri specifici corneei . În mod consecvent, rezultatele noastre imunostimulante și PCR în timp real au arătat că celulele au fost K3 și K12 negative, confirmând originea lor limbus. Connexina 43 este un membru al familiei proteinelor de joncțiune gap; permite difuzia directă a substanțelor dizolvate cu greutate moleculară mică între celulele vecine. Connexina 43 a fost raportată a fi exprimată prin celule epiteliale diferențiate , iar absența acestor molecule de comunicare intercelulară poate fi o caracteristică a celulelor stem epiteliale.
în rezultatele noastre, un procent mai mare de celule au exprimat p63 și ABCG2, în timp ce puține celule exprimă markeri de diferențiere K3/K12 și CX43. Astfel, celulele stem epiteliale limbale umane din mediul fără ser SR au prezentat fenotipuri similare și mențin condiții nediferențiate, comparativ cu mediul FBS.
în concluzie, folosind KnockOut SR înlocuind FBS, noul nostru mediu fără ser menține creșterea și proliferarea celulelor epiteliale corneene umane și reține celulele stem epiteliale în fenotipul lor nediferențiat. Această nouă metodă de cultură fără ser este definită de supliment și relativ ușor de controlat. Are un mare potențial de a fi utilizat în transplantul de celule epiteliale limbale și regenerarea țesuturilor.
interese concurente
autorii declară că nu au interese concurente.
mulțumiri
această lucrare a fost susținută de grant de la Universitatea Jilin și Fundația Națională de științe Naturale din China (NSFC 30500548).
