baza structurală pentru recunoașterea lanțului Ub legat de K48 de către receptorul proteazomal Rpn13

lanțul Ub legat de K48 fluctuează dinamic între mai multe conformații

am folosit smFRET pentru a evalua dispunerea spațială a celor două subunități Ub în K48-diub fără ligand. Am introdus fluorofori, Alexa Fluor 488 și Cy5, la capătul N al Ub distal și capătul C al UB proximal (Fig suplimentar. S1a). Folosind algoritmul de maximizare a așteptărilor32, profilul smFRET al K48-diUb poate fi cel mai bine descris ca trei specii de FRET suprapuse (Fig suplimentar. S2). Speciile cu FRET ridicat, mediu și scăzut sunt centrate la eficiențe de FRET de 0,74, 0,57 și 0,23, cu populațiile respective de ~48, ~39 și ~13% (Fig. 1a). Distanțele FRET dintre centrul fluoroforilor sunt calculate la ~43, ~50 ,~ 64, respectiv. Astfel, speciile înalte, medii și joase pot fi atribuite stărilor compacte, semi-deschise și deschise care sunt preexistente pentru K48-diUb.

a cu fluorofori conjugați la locul 76 C al UB proximal și 0 C al UB distal (cf. Fig Suplimentar. S1A), profilul smFRET poate fi montat pe trei specii de FRET suprapuse. Dacă nu se specifică altfel, această pereche de site-uri de conjugare sunt utilizate pentru toate studiile smFRET ale K48-diUb. Specia cu FRET ridicat (roșu colorat) corespunde unei stări compacte preexistente. b-d starea compactă poate fi îmbogățită selectiv prin Rpn13 de lungime completă, iar creșterea populației poate fi montată pe o Izotermă de legare. de exemplu, starea compactă poate fi îmbogățită selectiv prin Rpn13NTD, iar creșterea populației poate fi montată pentru a fi o Izotermă obligatorie. h cu fluoroforii conjugați la siturile N25C/N25C, Rpn13NTD poate îmbogăți selectiv starea compactă preexistentă a diubului distal al K48-tetraUb (cf. Fig Suplimentar. S5), oferind o afinitate obligatorie. Populațiile speciilor smFRET sunt medii pe trei măsurători independente, Erorile indicând 1 SD; valorile KD sunt raportate ca erori de montare best fit

fluctuația conformațională a K48-diUb a fost investigată anterior folosind smFRET26. În acest studiu, autorii au rezolvat două specii smFRET pentru K48-diUb, și anume specii cu FRET ridicat și cu FRET scăzut, cu eficiențe de FRET central la 0,69 și, respectiv, 0,41, în plus față de o specie fără FRET. Autorii au arătat că titrarea unui OTUB1 inactivat (OTUB1i), o deubiquitinază specifică pentru legătura izopeptidică K4833, îmbogățește în principal speciile cu FRET scăzut. Observația lor a condus la propunerea că K48-diUb poate fi recunoscut în mod specific de OTUB1 printr-un mecanism de selecție conformațional. Aici am repetat titrarea smFRET și am constatat că OTUB1i îmbogățește specia medium-FRET (suplimentar Fig. S3a-c). În plus, creșterea populațională a speciilor de FRET mediu la titrarea OTUB1i poate fi montată pe o Izotermă de legare cu o valoare KD de 7,7 0.1 mm (suplimentar Fig. S3d), care este aproape de valoarea KD raportată anterior26. Astfel, speciile cu FRET mediu din studiul de față ar trebui să corespundă speciilor cu FRET scăzut din studiul anterior, iar discrepanța poate apărea din diferite eficiențe de numărare a fotonilor și rutine de montare a urmelor de timp smFRET.

pentru a confirma în continuare că K48-diUb fluctuează între trei stări conformaționale preexistente, am introdus fluorofori la perechi suplimentare de situsuri de conjugare a fluoroforilor (Fig suplimentar. S1b-d). Pentru siturile alternative, deși eficiența centrală a speciilor de FRET diferă, profilurile smFRET pot fi descrise în continuare ca trei specii de FRET suprapuse cu populații similare (Fig suplimentar. S4). De exemplu, pentru siturile de conjugare 25 C/25 C, speciile cu FRET ridicat, mediu și scăzut sunt centrate la eficiențe de FRET de 0,68, 0,54 și 0,21, cu populațiile respective de ~48%, ~43% și ~9% (Fig suplimentar. S4d). Astfel, conjugarea fluoroforilor este puțin probabil să perturbe structura proteinei, iar măsurătorile smFRET au evidențiat dinamica conformațională inerentă a K48-diUb indiferent de locul de conjugare, adică K48-diUb alternează între trei stări distincte în absența unei proteine partenere.

pentru a evalua în continuare dacă subunitățile Ub în lanțul Ub mai lung legat de K48 fluctuează, de asemenea, între mai multe stări conformaționale, am analizat profilul smFRET al tetra-ubiquitinei legate de K48 (K48-tetraUb). Am conjugat fluoroforii la două situsuri N25C din diubul distal (cu respect față de diubul proximal) al K48-tetraUb. Profilul smFRET poate fi, de asemenea, potrivit ca trei specii de FRET suprapuse (suplimentar Fig. S5a). Deși populațiile relative ale celor trei specii sunt diferite de cele ale unui K48-diUb izolat cu fluorofori conjugați în aceleași locuri (Fig suplimentar. S4d), eficiența centrală a fretului speciilor FRET sunt aproape identice. Astfel, stările conformaționale ale unității diUb sunt probabil păstrate în lanțul Ub legat de K48 mai lung, în timp ce diferența dintre populațiile relative poate fi rezultatul efectului modulator al diubului proximal.

specia cu FRET ridicat este îmbogățită selectiv cu Rpn13

pentru a evalua relația dintre dinamica conformațională a lanțului Ub legat de K48 și recunoașterea Rpn13, am titrat 150 pM fluorofor marcat K48-diUb cu proteina Rpn13 de lungime întreagă umană. Interesant este că la adăugarea a 100 nM Rpn13, specia preexistentă cu FRET ridicat de K48-diUb este îmbogățită de la ~48% la ~57% (Fig. 1a, b), în timp ce populația speciilor cu FRET mediu și scăzut scade. Populația speciilor cu FRET ridicat continuă să crească cu mai multe Rpn13 adăugate (Fig. 1C), iar izoterma de legare poate fi montată la o valoare KD de 119 de 24 nm (Fig. 1d).

s-a demonstrat anterior că Rpn13NTD este în principal responsabil pentru legarea UB6,7. Astfel, am efectuat titrarea smFRET pentru 150 pM marcat cu fluorofor K48-diUb folosind doar Rpn13NTD cuprinzând doar primele 150 de reziduuri. Rpn13NTD îmbogățește, de asemenea, selectiv speciile cu FRET ridicat de K48-diUb (Fig. 1e, f). Creșterea populației speciilor cu FRET ridicat poate fi montată pentru a permite o valoare KD de 33,1 6,9 nm (Fig. 1g), ceea ce reprezintă o creștere de aproximativ 4 ori a afinității în comparație cu Rpn13 de lungime completă. Dacă fluoroforii sunt atașați în locuri alternative de conjugare (Fig suplimentar. S1B și S4B), titrarea Rpn13NTD determină, de asemenea, îmbogățirea speciilor de FRET echivalente urmând o tendință similară, oferind o valoare KD aproape identică (suplimentar Fig. S6). Astfel, apariția reziduurilor suplimentare poate avea un efect inhibitor mic asupra interacțiunii dintre Rpn13NTD și K48-diUb.

în plus, am efectuat titrarea smFRET pentru 150 pm K48-tetraUb cu fluorofori conjugați la diubul distal (suplimentar Fig. S5a). Titrarea Rpn13NTD îmbogățește selectiv speciile preexistente cu FRET ridicat ale diubului distal marcat cu fluorofor (suplimentar Fig. S5B-d), iar izoterma de legare poate fi montată la o valoare KD de 214 de 70 nm (Fig. 1h). Reducerea de 7 ori a afinității de legare comparativ cu Rpn13NTD:interacțiunea K48-diUb poate fi atribuită auto-asocierii dintre diub distal și diub proximal34, făcând suprafața de legare mai puțin disponibilă pentru legarea Rpn13. Important, pentru toate titrările smFRET ale K48-diUb sau K48-tetraUb, eficiența centrală a speciilor cu FRET ridicat se schimbă puțin în absența sau prezența Rpn13 sau Rpn13NTD. Aceasta înseamnă că Rpn13 se leagă de o conformație preexistentă a K48-diUb printr-un mecanism de selecție conformațional, indiferent dacă K48-diUb este de la sine sau face parte din lanțul Ub mai lung. De asemenea, înseamnă că specia cu FRET ridicat, adică starea compactă preexistentă a K48-diUb, nu este complet închisă și este gata să interacționeze cu alte proteine. Important, îmbogățirea selectivă a speciilor cu FRET ridicat indică, de asemenea, că Rpn13 ar trebui să interacționeze cu ambele subunități Ub în același timp.

Rpn13 se leagă preferențial de diubul legat de K48

pentru a evalua specificitatea legării Rpn13 pentru legătura K48, am evaluat afinitățile de legare dintre Rpn13 și alte tipuri de proteine Ub. Odată cu titrarea a 200 nM Rpn13NTD în 150 pM marcat cu fluorofor K48-diUb, populația speciilor cu FRET ridicat crește cu 15% de la ~48% la ~63% (Fig. 1f). La această concentrație, legarea K48-diUb nu este încă saturată cu Rpn13NTD (Fig. 1g) și, prin urmare, populația speciilor cu FRET ridicat este sensibilă la modificări mici ale concentrației Rpn13NTD disponibile. K48-diUb neetichetat poate concura pentru legarea la Rpn13NTD cu K48-diUb marcat cu fluorofor. Odată cu adăugarea a 150 pM K48-diUb neetichetat, populația speciilor cu FRET ridicat scade cu 7,5%, ceea ce corespunde unei inhibiții de 50% a K48-diub marcat cu Fluorofor legat de Rpn13NTD (Fig. 2a). Odată cu adăugarea a 300 pM neetichetat K48-diUb, populația speciilor cu FRET ridicat scade cu 11%, însumând un total de 73% inhibiție (Fig. 2b). Ca atare, ambele etichetate cu fluorofor și neetichetate K48-diUb concurează pentru aceeași interfață de legare pe Rpn13 cu afinitate de legare similară. Aceasta înseamnă, de asemenea, că conjugarea fluoroforilor la K48-diUb provoacă o mică perturbare a interacțiunii dintre Rpn13NTD și K48-diUb.

A, B adăugarea de 200 nM Rpn13NTD îmbogățește mai întâi speciile cu FRET ridicat de K48-diub marcat cu fluorofor (cf. Figura 1f) și adăugarea suplimentară de 150 pM și 300 pM fără etichetă K48-diUb scad populația speciilor cu FRET ridicat. C, D adăugarea de 150 pM și 300 pM monomerul UB neetichetat are un efect neglijabil asupra populației speciilor cu FRET ridicat. E, F adăugarea de 150 pM K48-diUb și 150 pM M1-diUb determină o scădere foarte mică a populației speciilor cu FRET ridicat

mai mult, la amestecul de 200 nM Rpn13NTD și 150 pM fluorofor marcat K48-diUb, am adăugat monomer UB neetichetat, diubiquitină legată de K63 sau diubiquitină legată de M1, pentru a evalua dacă alte tipuri de Ub pot deplasa K48-diUb. Populația speciilor cu FRET ridicat se schimbă puțin cu adăugarea de monomer Ub de 150 pM sau 300 pM (Fig. 2c, d). Odată cu adăugarea a 150 pm K63-diUb și 150 pM M1-diUb, populația speciilor cu FRET ridicat este, de asemenea, neschimbată în intervalul de eroare (Fig. 2e, f). Pe de altă parte, titrarea directă a 1 unqqm Rpn13NTD în K63-diUb conjugat cu fluorofori și M1-diUb provoacă puține modificări ale profilelor lor preexistente smFRET (Fig suplimentar. S7). Împreună, Rpn13NTD interacționează selectiv cu K48-diUb.

structura soluției Rpn13NTD:Complexul K48-diUb

deși am arătat acum Rpn13NTD interacționează selectiv cu K48-diUb, numai structura complexă dintre Rpn13NTD și monomerul Ub a fost determinată6,8. Pentru a înțelege modul în care cele două subunități din K48-diUb pot interacționa simultan cu Rpn13NTD, ne-am propus să determinăm structura soluției complexului Rpn13NTD:K48-diUb folosind rezonanță magnetică nucleară (RMN). La formarea complexului proteic, reziduurile interfaciale ar experimenta un mediu local diferit și, prin urmare, ar afișa semnale RMN. Am constatat că, titrarea K48-diUb neetichetat la Rpn13 marcat cu 15N provoacă perturbații mari de deplasare chimică (CSP), care implică în principal reziduurile 73-83 și 93-106 (Fig. 3a). Aceste reziduuri formează o suprafață contiguă pe Rpn13, acoperind o suprafață mai mare decât se aștepta din structura complexă determinată anterior între Rpn13NTD și Monomer UB6,7. Pe de altă parte, titrând rpn13ntd neetichetat la K48-dUb, fie cu marcajul UB 15N proximal, fie distal, iar cealaltă subunitate neetichetată, CSP-urile sunt observate în principal pentru reziduurile din regiunea foilor de la XV a ambelor subunități Ub. Unele dintre reziduurile interfaciale au dispărut și la formarea complexului (Fig. 3b, c).

a-C CSP a avut o medie de peste 1h și 15N dimensiuni ale protonilor amidici ai coloanei vertebrale la formarea complexului cu proteine marcate cu izotopi de 0,2 mM și neetichetate. Inserturi: subunitatea marcată cu 15N este ilustrată cu reprezentarea suprafeței, iar reziduurile de culoare roșie au CSP deasupra liniei punctate. d, e cu o sondă paramagnetică conjugată la locul e24c al Ub distal, au fost evaluate raporturile de intensitate dintre spectrele paramagnetice și diamagnetice și valorile pre-Inqc2 pentru protonii amidici ai coloanei vertebrale cu Rpn13NTD marcat cu 15N. Cutiile gri au indicat reziduuri cu PREs intermolecular foarte mare. f cu sonda paramagnetică conjugată la situsul n25c al UB proximal, s-au măsurat valori de la 0,2 pentru protonii amidici ai UB distal marcat cu 15N în K48-diUb. Barele de eroare indică 1 S. D., iar reziduurile complet lărgite în complex sunt notate cu stele

Nuclear Overhauser effect (NOE) raportează relația la distanță (<6 inkt) între nuclee. Mai mult, experimentul RMN 13C semi-filtrat poate furniza NOE între protonul legat de 12C și protonul legat de 13C, adică relația la distanță intermoleculară. Am obținut Noe intermoleculare între Rpn13NTD și UB proximal, între Rpn13NTD și UB distal și între UB proximal și UB distal (Fig suplimentar. S8). Mai mult, am conjugat o sondă paramagnetică maleimide-EDTA-MN2 + la locul e24c al Ub distal și am colectat îmbunătățirea relaxării paramagnetice (PRE) pentru protonii amidici din coloana vertebrală a Rpn13NTD, urmând protocolul stabilit22,35. După cum s-a evaluat fie prin raportul de intensitate maximă al spectrelor paramagnetice versus diamagnetice, fie prin rata de creștere a relaxării transversale a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de creștere a vitezei de 3d, e). De asemenea, am conjugat sonda paramagnetică la locul N25C al UB proximal și am evaluat rata de îmbunătățire a relaxării transversale a Ub distal (Fig. 3f). Valorile PRE mari sunt observate între cele două subunități Ub ale diubului K48 fără ligand, iar adăugarea Rpn13NTD crește PREs inter-Ub, dar cu un profil PRE similar. Experimentele pre RMN confirmă astfel că Rpn13NTD îmbogățește starea compactă preexistentă a K48-diUb.

pentru a rafina Rpn13NTD:Structura complexă K48-diUb împotriva restricțiilor experimentale, am efectuat andocarea rigidă a corpului cu libertatea unghiului de torsiune acordată reziduurilor de linker diUb și lanțurilor laterale ale reziduurilor interfaciale. Pentru cei 20 de conformatori cu cea mai mică energie, deviația rădăcină-medie-pătrată (RMS) pentru atomii grei ai coloanei vertebrale a tuturor reziduurilor rigide este de 0,86 0,54 0,54 (suplimentar Fig. S9 și tabelul S1). Cele două subunități Ub ale K48-diUb rămân asociate în complexul, îngropând suprafața accesibilă a solventului (Sasa) de ~1130 Unktov2. Pe de altă parte, rpn13ntd se înclină, îngropând ~940 Inkt2 de SASA cu UB proximal și ~1300 Inkt2 de Sasa cu UB distal (Fig. 4a). Structura complexă dintre Rpn13NTD și UB proximal al K48-diUb în studiul de față este similară cu structura complexă cunoscută între Rpn13NTD și monomer6 Ub,7, cu diferența RMS pentru atomii grei ai coloanei vertebrale 2,17 0,31 inkt (suplimentar Fig. S10a). Interesant este că, deși reziduurile hidrofobe L8, I44 și V70 din UB proximal sunt implicate pentru interacțiunea cu Rpn13, aceleași trei reziduuri din UB distal sunt îngropate în interfața Ub-Ub.

o structură a complexului Rpn13NTD: K48-diUb. Formarea complexului îngroapă interfețe extinse între subunități. B suprafețe cu potențial Electrostatic de Rpn13NTD și UB distal de K48-diUb, trase la scara 3 KBT de la hectar. Reziduurile R104 în Rpn13NTD și D39 în UB distal sunt prezentate ca bile și bastoane. c r104e mutația inversării sarcinii în Rpn13NTD determină o scădere de 300 de ori a afinității de legare pentru K48-diUb, evaluată de smFRET (cf. Fig Suplimentar. S11). Valoarea KD este raportată ca erori de montare best fit. D analizele Western blot arată că transfecția mutantului Rpn13 R104E (cu un steag n-terminal) crește cantitatea totală de proteine poliub legate de K48 în celulă. viabilitățile celulelor e la șocul termic (în raport cu celulele fără șoc termic) arată că transfecția mutantului Rpn13 R104E, dar nu a tipului sălbatic Rpn13, conferă termotoleranță. * P < 0, 05, ***P < 0.001, pentru a controla celulele din același grup, nepereche t-test; ##P < 0,01, # # # p < 0,001, la celulele netratate cu șoc termic, unidirecțional ANOVA; &&P < 0.01, &&&P < 0.001, la celulele transfectate de tip sălbatic Rpn13 cu șoc termic, ANOVA unidirecțională

structura complexă Rpn13NTD: K48-diUb poate fi, de asemenea, coroborată cu date FRET cu o singură moleculă. Pe baza structurii complexe, am modelat fluoroforii la locurile lor de conjugare în K48-diUb. Distanța medie este 43.2 5.8 0,73 0,13 între centrii geometrici ai inelelor aromatice fluorofore, ceea ce corespunde unei eficiențe teoretice a fretului de 0,73 0,13 (suplimentar Fig. S10b). Această valoare este aproape aceeași cu eficiența centrală observată pentru speciile cu FRET ridicat (Fig. 1a).

întreruperea Rpn13NTD: interacțiunea UB distală determină acumularea de proteine ubiquitinate în celula

în structura complexă dintre Rpn13NTD și K48-diUb, interacțiunea dintre Rpn13NTD și UB proximal este similară cu cea dintre Rpn13NTD și monomerul Ub, așa cum s-a raportat anterior (Fig suplimentar. S10a). Astfel, am conceput experimente pentru a evalua importanța funcțională pentru interacțiunea dintre Rpn13NTD și Ub distal al K48-diUb. Multe reziduuri încărcate sunt situate la interfața dintre Rpn13NTD și UB distal al K48-diUb și, prin urmare, forța electrostatică poate juca un rol important pentru stabilizarea complexului (Fig. 4b). Dintre acestea, reziduul D39 din UB distal este aproape de reziduul R104 din Rpn13. Am mutat astfel reziduul Rpn13 R104 la un glutamat și am titrat Rpn13NTD mutant la K48-diUb marcat cu fluorofor. Proteina mutantă îmbogățește speciile cu FRET ridicat de K48-diUb(Fig suplimentar. S11). Cu toate acestea, afinitatea de legare devine mult mai slabă. Izoterma de legare poate fi montată la o valoare KD de 10,0 xtct 3,3 xtctm, de aproximativ 300 de ori mai slabă decât wildtype Rpn13NTD (Fig. 4c). Ca atare, asocierea cu UB distal este importantă pentru recunoașterea specifică între Rpn13 și K48-diUb.

afinitatea de legare scăzută a mutantului R104E ne-a permis să evaluăm importanța funcțională a interacțiunii dintre Rpn13 și lanțul Ub legat de K48. Transfecția tranzitorie a tipului sălbatic Rpn13 crește ușor cantitatea de proteine poliub legate de K48 (Fig. 4d). Este posibil ca, la transfecția Rpn13, o cantitate excesivă de Rpn13 liber să concureze pentru legarea la proteinele poliub legate de K48 cu Rpn13 asociat cu proteazom, făcând astfel recrutarea proteinelor substrat ubiquitinate la proteazom mai puțin eficientă. Pe de altă parte, transfecția mutantului Rpn13 R104E crește foarte mult cantitatea de proteine poliubice legate de K48, comparativ cu celulele transfectate cu Rpn13 de tip sălbatic (Fig. 4d). Ca un control pozitiv, am incubat celulele cu 1 centimm MG132, un inhibitor puternic al proteazomilor36. Datorită blocării degradării proteinelor labile, adăugarea de MG132 crește semnificativ cantitatea de proteine poliub legate de K48. Luate împreună, mutația R104e a Rpn13 poate duce la acumularea de proteine substrat ubiquitinate. Acest lucru poate fi atribuit interacțiunii mai slabe dintre mutantul Rpn13 asociat proteazomului și K48-diUb și K48-poyUb.

șocul termic poate reduce viabilitatea celulelor. Am constatat că șocul termic de 30 de minute la 43 de centi C poate reduce viabilitatea celulelor HEK293 la 75%. Similar cu rapoartele anterioare36, 37, am constatat, de asemenea, că tratamentul MG132 are un efect protector asupra supraviețuirii celulare la șocul termic, viabilitatea celulară scăzând la ~90% (Fig. 4e). Acest lucru se datorează faptului că MG132 inhibă degradarea proteazomală, făcând mai disponibile proteinele de șoc termic cu viață scurtă (Fig. 4d). De asemenea, am testat viabilitatea celulelor șocate de căldură transfectate cu Rpn13 de tip sălbatic și nu am găsit nicio diferență semnificativă față de celulele de control fără transfecția Rpn13. Pe de altă parte, viabilitatea celulară a celulelor transfectate Rpn13 R104E a scăzut la ~83% în urma șocului termic, care este semnificativ mai mare decât cea a celulelor de control și a celulelor transfectate cu Rpn13 de tip sălbatic (Fig. 4e). Aceasta implică faptul că Rpn13 mutant are un efect protector asupra supraviețuirii celulare la șocul termic, similar cu efectul MG132. Luate împreună, interacțiunea dintre Rpn13 și lanțul Ub legat de K48 este esențială pentru recunoașterea mediată de Rpn13 a proteinelor substratului ubiquitinat de către proteazom, în timp ce o mutație punctuală interfacială în Rpn13 poate provoca acumularea anumitor proteine de substrat, cum ar fi proteinele de șoc termic, și conferă termotoleranță celulelor transfectate.

Rpn13NTD:interacțiunea K48-diUb poate fi direcționată pentru a modula funcția Rpn13

Rpn13 este recrutat dinamic la proteazom prin interacțiunea dintre Rpn13NTD și coada C-terminală a Rpn27,13. Structura complexă de aici indică faptul că interfața de legare pe Rpn13NTD pentru Rpn2 este aproape, dar nu se suprapune cu interfața de legare pentru UB distal al K48-diUb (Fig. 5a). Astfel, am preamestecat ultimele 16 reziduuri de Rpn2 (Rpn2CTD) cu Rpn13NTD sau cu Rpn13 de lungime completă la raportul 1:1 și am titrat Rpn13NTD:Rpn2CTD complex la K48-diUb marcat cu fluorofor. Preamestecarea Rpn2CTD a crescut valoarea KD a Rpn13NTD: K48-diUb de la 33,1 la 6,9 nm (Fig. 1g) până la 66,8 XTX 13,9 nM (suplimentar Fig. S12a-c și Fig. 5b), în timp ce a scăzut valoarea KD a Rpn13:K48-diUb de la 119 la 24 nM (Fig. 1D) până la 43,9 XTX 12,8 nM (suplimentar Fig. S12d-f și Fig. 5c). Astfel, oferind incertitudinile de măsurare, asocierea Rpn2CTD provoacă doar mici perturbații pentru afinitatea de legare dintre Rpn13 și K48-diUb, care poate avea legătură și cu prezența linker și domeniul C-terminal al Rpn13.

a suprafața de legare a Ub distal de K48-diUb pe Rpn13NTD este adiacentă suprafeței de legare a Rpn2CTD. Cu structura complexă Rpn13NTD-Rpn2CTD (Cod PDB 5V1Y) suprapusă de Rpn13NTD, Rpn2CTD este prezentat ca desen animat roșu. Reziduul Rpn13 K34 este aproape de capătul C al UB distal (prezentat ca o linie punctată). afinitățile de legare B, c au fost obținute din titrările smFRET ale rpn13ntd echimolare: Rpn2CTD sau Rpn13: Rpn2CTD la K48-diUb marcat cu fluorofor. Valorile KD sunt raportate ca erori de montaj best fit . D legarea monomerului Ub ancorat Rpn2 ocupă probabil aceeași suprafață de legare a UB distal, provocând deplasarea acestuia din urmă. e, f experimentele de concurență smFRET, cu adăugarea suplimentară a proteinei de fuziune Rpn2CTD-Ub de 150 pM, la amestecul de 200 Nm Rpn13NTD sau Rpn13 de lungime completă și 150 pM marcat cu fluorofor K48-diUb (c.F. figura 1C și f). Eroarea indică 1 S. D. din trei măsurători independente ale populațiilor speciilor smFRET

Rpn2 și UB distal de K48-diUb ocupă suprafețele din apropiere pe Rpn13NTD. Prin urmare, o proteină de fuziune cu Monomer Ub atașat la capătul C al Rpn2CTD poate ieși și interfera cu interacțiunea dintre Rpn13NTD cu UB distal al K48-diUb (Fig. 5d). După cum am arătat, adăugarea de 200 nM Rpn13NTD crește populația speciilor cu FRET ridicat de 150 pM marcat cu fluorofor K48-diUb la ~63% (Fig. 1f), în timp ce adăugarea monomerului Ub nu poate concura pentru legarea Rpn13NTD (Fig. 2c, d). Când am adăugat proteine suplimentare de fuziune Rpn2CTD-Ub de 150 pM neetichetate, populația speciilor cu FRET ridicat scade cu ~4% până la ~59% (Fig. 5e). Pe de altă parte, am arătat că, adăugarea de 200 nM Rpn13 de lungime completă crește populația speciilor cu FRET ridicat de 150 pM marcat cu fluorofor K48-diUb la ~60% (Fig. 1c). Adăugarea suplimentară de 150 pM proteină de fuziune rpn2ctd-Ub neetichetată scade populația speciilor cu FRET ridicat cu ~4,5 până la ~55,5% (Fig. 5f). Rețineți că adăugarea unui Ub la Rpn2CTD nu are aproape niciun efect asupra interacțiunii dintre Rpn2CTD și Rpn13NTD (Fig suplimentar. S13). Astfel, datele noastre indică faptul că interfețele de legare Rpn2 și K48-diUb pe Rpn13NTD sunt apropiate una de cealaltă. Mai important, Rpn2-ancorat UB poate bloca fizic accesul diubului distal la Rpn13 și poate slăbi interacțiunea dintre K48-diUb și Rpn13.