folosind tehnica DBE, am colectat sistematic biopsii din întregul tract intestinal uman și am caracterizat distribuția celulelor enteroendocrine K și L și expresia produselor lor hormonale la persoanele sănătoase și persoanele cu diabet zaharat de tip 2.
deoarece diabetul de tip 2 implică excesul de greutate/obezitatea și homeostazia disfuncțională a glucozei care ar putea fi corelată cu modificările celulelor enteroendocrine K și L, studiul a fost conceput pentru a descrie modelul de distribuție al acestor celule și expresia unora dintre produsele lor în cele două grupuri de voluntari recrutați prospectiv, de dimensiuni similare, bine definite și potrivite, fără tulburări gastro-intestinale cunoscute. Folosind DBE, a fost posibil să se obțină un număr mare de probe pe întregul tract intestinal: din nouă regiuni anatomice specifice (Fig. 1) și 7-22 ‘stații’ de-a lungul jejunului și ileonului. Biopsiile din zonele bine definite anatomic au fost foarte comparabile. Există o incertitudine mai mare în ceea ce privește locațiile biopsiei în jejun și ileonul proximal (locațiile biopsiei 3-9, Fig. 1) datorită lungimii variabile a intubației și, prin urmare, a numărului de probe obținute între indivizi. Pentru a rezolva această problemă, am împărțit sistematic jejunul și ileonul în șapte regiuni (vezi metode). Marcajul de cerneală submucoasă plasat la adâncimea maximă de inserție în timpul enteroscopiei anterograde a fost observat în timpul enteroscopiei retrograde la patru din 24 de persoane, indicând enteroscopia totală (Fig. 2). Se presupune că cea mai mare parte a tractului intestinal a fost investigată în restul participanților, după cum este judecat de lungimea intubației realizate (pentru detalii, consultați lucrarea metodologică ).
am utilizat imunohistochimia și numărul de celule pentru a cuantifica celulele enteroendocrine și enzimele de procesare a prohormonilor și analiza expresiei ARNm qPCR pentru a evalua produsele hormonale/enzimatice. Ambele metode sunt bine stabilite, dar, de asemenea, prezintă limitări. O specificitate ridicată a anticorpilor utilizați în imunohistochimie este de mare importanță pentru a asigura un minim de colorare nespecifică (fals pozitive). În consecință, am ales anticorpi care sunt bine stabiliți și bine caracterizați . Folosind imunohistochimia și numărul de celule din microfotografiile biopsiilor feliate, obiectele tridimensionale (adică celulele enteroendocrine) sunt evaluate cu o tehnică imagistică bidimensională. O tehnică mai optimă pentru evaluarea distribuției celulare ar fi stereologia, în care se estimează densitatea reală (adică celule/țesut mm3). Cu toate acestea, această tehnică ar necesita blocuri transversale complete de țesut, care este incompatibil cu numărul mare de site-uri de biopsie și, prin urmare, cartografierea detaliată a tractului intestinal la oamenii vii, care a fost vizată în studiul de față. În plus, ar trebui luate în considerare următoarele. În primul rând, evaluarea expresiei ARNm indică activitatea celulelor endocrine, dar nu oferă o măsură a producției totale a unui anumit produs celular, deoarece nu toate ARNm sunt traduse într-un produs activ final. În al doilea rând, expresia este relativă, deoarece transcrierile specifice ARNm sunt legate de expresia unei gene exprimate stabil (vezi metode ESM pentru detalii suplimentare). Având în vedere eterogenitatea biologică a diabetului de tip 2, ar fi putut fi detectate diferențe mai pronunțate cu o dimensiune mai mare a eșantionului și includerea pacienților cu o dereglare mai extinsă a glucozei.
lucrarea lui SJ Uniclund et al din 1983 privind distribuția celulelor enteroendocrine este cea mai detaliată realizată în intestinul uman până în prezent folosind IHS cu o gamă largă de antiseruri (25 de tipuri) împotriva peptidelor neurohormonale intestinale cunoscute sau propuse . Tehnicile minim invazive nu erau disponibile la acel moment. În consecință, probele au fost preluate din doar șapte regiuni: duodenul proximal și distal, jejunul Mijlociu, ileonul distal, colonul ascendent, partea distală a colonului transversal sau colonul sigmoid și rectul. Pentru fiecare regiune, Materialul tisular a fost obținut de la 9-17 persoane. Probele au fost prelevate fie în timpul intervențiilor chirurgicale abdominale (efectuate în principal din cauza malignității), fie în timpul examinărilor enteroscopice care au implicat biopsii la persoane cu ‘alte tulburări gastro-intestinale’, incluzând o varietate de simptome și boli nespecificate (de exemplu ‘sângerări oculte’ și ‘boli hepatice’). În 1985, Adrian și colab .au folosit o tehnică de radioimunoanaliză pentru a determina cantitatea de PYY în fondul gastric și antrum, duoden, jejun, ileon, colon ascendent, colon sigmoid și rect. Probele din fiecare locație au fost obținute de la 5-8 persoane supuse unei intervenții chirurgicale din cauza carcinomului sau a ulcerului gastric. În 1992, un studiu care investighează distribuția celulelor l enteroendocrine la om a fost raportat de Eissele și colab . Probele au fost obținute din șapte regiuni: duoden, jejun proximal și distal, ileon, colon ascendent, colon transversal și rect. Probele au fost obținute de la doar cinci participanți care au suferit o intervenție chirurgicală pentru carcinom sau boala Crohn. În 2005, Guedes și colab au investigat distribuția celulelor GIP -, GLP-1 și, respectiv, CGA – pozitive, utilizând IHS pe probe de la fiecare 20 cm din intestinul subțire la 30 de cadavre umane .
trebuie subliniat faptul că cele patru studii menționate mai sus au investigat probe de țesut cu aspect normal, fără semne de modificări patologice. Cu toate acestea, prezența modificărilor maligne sau inflamatorii în zona intestinală sau începerea rapidă a degradării celulare post mortem ar fi putut influența distribuția și funcția generală a celulelor enteroendocrine. Mai mult, eterogenitatea participanților ar fi putut influența rezultatele.
în acord cu rezultatele noastre, SJ Unixtlund et al, Eissele et al, Adrian et al și, respectiv, Guedes et al, au descris variația produselor celulare L (GLP-1 și/sau PYY) în funcție de localizarea intestinului , cu o densitate/cantitate mai mare în jejunul distal și ileon comparativ cu duodenul și jejunul proximal și o densitate/cantitate în creștere de la colonul proximal la cel distal, cu cele mai ridicate niveluri în rect . Rezultatele noastre susțin acest model de distribuție a celulelor L la persoanele sănătoase și în diabetul de tip 2, cu creșterea expresiei genei GCG și PYY, precum și creșterea densității celulelor GLP-1 și PYY-pozitive, de-a lungul intestinului subțire și de-a lungul colonului. De asemenea, am observat cel mai mare semnal al markerilor celulelor l (celule PYY – și GLP-1-pozitive și expresia ARNm PYY) în rect, cu excepția expresiei GCG. Implicațiile—dacă există-ale diferențelor observate între grupuri (GCG semnificativ mai mare și expresia PYY în colonul participanților cu diabet zaharat de tip 2 comparativ cu persoanele sănătoase) sunt în prezent necunoscute. Este bine stabilit că efectul incretin este redus în diabetul de tip 2 și s-a propus că un defect al secreției de GLP-1 indusă de nutrienți poate contribui la explicarea acestui fenomen. Cu toate acestea, studiile care investighează răspunsurile GLP-1 la stimulii nutritivi la cei cu diabet zaharat de tip 2 și la persoanele non-diabetice au arătat că, în general, persoanele cu diabet zaharat de tip 2 nu prezintă răspunsuri GLP-1 totale plasmatice reduse .
am observat o discrepanță între nivelurile de Expresie GCG și densitatea celulelor GLP-1-pozitive de-a lungul intestinului. Acest lucru subliniază faptul că celulele L dintr-o parte a intestinului subțire se pot comporta diferit de celulele l enteroendocrine dintr-o altă parte a intestinului subțire, așa cum sugerează Svendsen și colab., care au observat că modelul de secreție al celulelor l se schimbă de-a lungul tractului gastro-intestinal la șobolani, adică celulele l secretă rapoarte diferite de PYY și GLP-1, unele secretând doar GLP-1. În conformitate cu aceste constatări, este probabil ca celulele l situate mai distal să exprime proglucagonul într-o măsură mai mare decât celulele l situate mai proximal.
constatările noastre privind expresia GIP mai mare și densitatea celulelor GIP pozitive în partea proximală a intestinului subțire, ambele scăzând distal până la regiunea ileocaecală la persoanele sănătoase și la cei cu diabet zaharat de tip 2, sunt în concordanță cu constatările anterioare . Spre deosebire de SJ Okticlund și colab., care au descoperit că celulele GIP pozitive sunt absente din intestinul gros, am reușit să detectăm niveluri scăzute de celule GIP pozitive în partea distală a tractului intestinal. Cu toate acestea, nu putem exclude faptul că acesta este un rezultat al legării nespecifice a anticorpilor. Cu toate acestea, am observat expresia ARNm a GIP în colonul ambelor grupuri, deși la niveluri foarte scăzute. Expresia GIP a fost semnificativ mai mare la persoanele cu diabet zaharat de tip 2 de-a lungul întregului tract intestinal. S-ar putea specula că transcrierea GIP este crescută ca rezultat compensator al rezistenței GIP, adică efectul insulinotropic redus al GIP observat la persoanele cu diabet zaharat de tip 2 . În conformitate cu aceasta, s-a demonstrat că nivelurile de GIP în condiții de repaus alimentar sunt mai mari la participanții cu diabet zaharat de tip 2 comparativ cu participanții de control non-diabetici și , în plus, s-a propus că GIP contribuie la hiperglicemia observată în diabetul de tip 2 (în principal datorită efectului glucagonotropic al GIP) . Cu toate acestea, datele privind răspunsurile GIP după glucoză orală sau mese mixte la persoanele cu diabet zaharat de tip 2 au fost inconsistente, iar o revizuire sistematică cu meta-analiză a sugerat că răspunsurile GIP postprandiale sunt similare la cei cu diabet zaharat de tip 2 și la persoanele sănătoase .
având în vedere că glicoproteina acidă CGA este o componentă a veziculelor celulare și considerată a juca roluri multiple în procesul secretor al produselor endocrine, este utilizată ca marker general al celulelor enteroendocrine . Spre deosebire de Guedes și colab, care au observat o densitate constantă a celulelor CgA-pozitive de-a lungul intestinului subțire, studiul nostru a arătat un declin semnificativ. Mai mult, am observat o densitate mai mare de celule CgA pozitive în intestinul subțire al persoanelor sănătoase decât participanții cu diabet zaharat de tip 2. S-ar putea specula că numărul total de celule CGA pozitive (celule enteroendocrine) este modificat în diabetul de tip 2—Fie ca o consecință a stării diabetice de tip 2, fie, poate, contribuind la patogeneza diabetului de tip 2. Am observat un număr destul de mare de celule CgA-pozitive în rectul ambelor grupuri. Recent, Engelstoft și colab au arătat la șoareci că CgA a fost localizată în principal la celulele enteroendocrine secretoare de monoamină și mai puțin la celulele enteroendocrine secretoare de peptide , susținând probabil propunerea SJ Okticlund și colab că celulele enteroendocrine rectale ar putea avea mai degrabă o funcție locală (paracrină) decât o funcție sistemică .
deoarece PC1 / 3 este cunoscut pentru a procesa prohormonii care duc la formarea GIP și, respectiv, GLP-1, ne-am așteptat să găsim prezența PC1/3 de-a lungul întregului tract intestinal. Am observat, respectiv, o discrepanță care implică o expresie mai mare a PCSK1/3 și densități mai mici ale celulelor PC1/3-pozitive în intestinul subțire al participanților cu diabet de tip 2 comparativ cu participanții sănătoși. După cum sa subliniat mai sus, această constatare ar trebui interpretată în opinia că unele celule enteroendocrine pot fi foarte active în unele regiuni și au o activitate scăzută în alte regiuni.
deoarece PC2 este cunoscut în primul rând pentru procesarea proglucagonului în glucagon în celulele alfa pancreatice, a fost interesant să se găsească expresia ARNm a celulelor PCSK2 și PC2-pozitive de-a lungul întregului tract intestinal. Acest lucru ar putea indica faptul că glucagonul este produs în intestin, așa cum a sugerat recent Lund și colab . În conformitate cu aceasta, s-ar putea specula că expresia PCSK2 mai mare în intestinul subțire al persoanelor cu diabet zaharat de tip 2 duce la formarea excesului de glucagon, contribuind la hiperglucagonemia diabetică de tip 2. Pentru a clarifica în continuare acest aspect, sunt justificate studii care includ dubla colorare imunohistochimică.
în concluzie, cartografierea actuală a distribuției celulelor enteroendocrine K și L și variațiile observate în nivelurile de Expresie ale produselor lor conexe de-a lungul tractului intestinal uman, combinate cu diferențele demonstrate între participanții cu diabet zaharat de tip 2 și persoanele sănătoase, oferă o lucrare de referință pentru oamenii de știință și clinicieni. Combinate cu cunoștințele din studiile fiziologice privind hormonii intestinali circulanți, datele noastre ar putea fi de valoare în înțelegerea modului în care intestinul contribuie la reglarea metabolismului glucozei și a apetitului. Identificarea PC2 în celulele enteroendocrine este interesantă, deoarece aceasta ar putea fi în concordanță cu formarea glucagonului în intestinul uman. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a demonstra această posibilitate și pentru a lega constatările noastre de fiziopatologia diabetului de tip 2.
