Doborârea și eliminarea genelor

doborârea genelor
această tehnică permite reducerea expresiei unuia sau mai multor organisme. Acest lucru poate apărea prin modificarea genetică sau prin tratamentul cu areagent, cum ar fi o oligonucleotidă scurtă de ADN sau ARN care are o secvență complementară fie genei, fie transcrierii ARNm.
dacă modificarea expresiei genei este cauzată de o legătură oligonucleotidă cu un ARNm sau se leagă temporar de o genă, aceasta duce la o schimbare temporară a expresiei genei care nu modifică ADN-ul cromozomial,iar rezultatul este denumit „knockdown tranzitoriu”.
într-un knockdown tranzitoriu, legarea acestei oligonucleotide la activegen sau transcrierile sale determină scăderea expresiei. Legarea poate avea loc prinblocarea transcrierii, degradarea transcrierii ARNm(de ex. siARN sau antisens dependent de RNase-H), fie prin blocarea translației ARNm, a siturilor de îmbinare pre-ARNm, fie a siturilor de clivaj nucleaz utilizat pentru maturarea altor ARNr funcționale, inclusiv miARN (e.g.by morfolino oligos).
cea mai directă utilizare a knockdown-urilor tranzitorii este pentru a învăța despre o genă carea fost secvențiat, dar are o funcție necunoscută. Această abordare experimentală este cunoscută sub numele de genetică inversă. Knockdown-urile tranzitorii sunt adesea folosite în biologia dezvoltării, deoarece oligo-urile pot fi injectate în zigoți unicelulari și vor fi prezente în celulele fiice ale celulei injectate.

interferența ARN (RNAi)este un mijloc de tăcere a genelor prin degradarea ARNm. Eliminarea genelorprin această metodă se realizează prin introducerea în citoplasmă a interferențelor mici dublu-catenarrna (siARN). Odată introduse în celulă, exogenesirnas sunt procesate de RISC. SiARN este complementar cu ARNm țintă care trebuie redus la tăcere, iar RISC folosește siARN ca șablon pentru localizarea ARNm țintă. După ce riscul se localizează la ARNm țintă, ARN-ul este scindat deo ribonuclează.
RNAi este utilizat pentru analiza funcțională genetică. Utilizarea RNAi poate fi utilă în identificarea potențialelor ținte terapeutice, a dezvoltării medicamentelor sau a altor aplicații.

eliminarea genelor
Geneknockout (KO) este o tehnică genetică în care una dintre genele unui organism este nefuncțională. Organismele Knockout sunt folosite pentru a studia funcția genică, de obiceiprin investigarea efectului pierderii genelor. Kos heterozigot și homozigot: în prima, o singură alelă este eliminată, în cea de-a doua ambele alele sunt eliminate.

crearea direcționată a unui KO începe în eprubetă cu o plasmidă,un cromozom artificial bacterian sau alt construct ADN șiprocedarea la cultura celulară. Celulele sunt transfectate cu DNAconstruct. Adesea scopul este de a crea un animal transgenic care aregena modificată.
dacă da, celulele stem embrionare sunt transformate genetic și inserate în embrioni timpurii. Animalele rezultate cu schimbarea genetică din celulele lor germinale pot trece adesea eliminarea genei la generațiile viitoare.

constructul este proiectat pentru a se recombina cu gena țintă, care se face prin încorporarea secvențelor din gena însăși în construct.Recombinarea are loc apoi în regiunea acelei secvențe din cadrul genei,rezultând inserarea unei secvențe străine pentru a perturba gena.
un knockout condiționat permite ștergerea genei într-un țesut sau o manieră specifică timpului. Acest lucru se face prin introducerea site-urilor loxP în jurul genei. Aceste secvențe vor fi introduse în linia germinativă prin același mecanism ca aknock-out. Această linie germinativă poate fi apoi traversată către o altă germinăconținând Cre-recombinază, care este o enzimă virală care poate recunoaște aceste secvențe, le recombină și șterge gena flancată de aceste site-uri.
deoarece recombinarea ADN este un eveniment rar, secvența străină aleasă pentru inserare include de obicei un reporter. Acest lucru permite o selecție ușoară decelule sau persoane în care knockout a avut succes. Uneori, dnaconstructul se introduce într-un cromozom fără omologul doritrecombinație cu gena țintă.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
este o tehnică prin care expresia unei gene este redusă. Această reducerepoate rezulta dintr-o modificare a ADN-ului sau dintr-o oligonucleotidă care se leagă fie de ARNm, fie de genă. În acest caz, schimbarea expresiei este temporară, deci noivorbim despre knockdown tranzitoriu.
una dintre tehnicile care permit eliminarea tranzitorie a unei gene constă în utilizarea oligomerilor Morfolino. Au devenit un instrument standard de eliminare în sistemele embrionare animale, astfel încât Morfolinooligii sunt adesea folosiți pentru a investiga rolul unei transcrieri specifice a ARNm înun embrion. Structura sa moleculară are baze ADN atașate la o coloană vertebrală a inelelor de metilenemorfolină legate prin grupuri fosforodiamidate. Morfolinos blochează accesul altor molecule la secvențe specifice mici (~25 de bază) ale suprafețelor de asociere a bazelor acidului ribonucleic (ARN). Deoarecedin coloana vertebrală complet nenaturală, Morfolinii nu sunt recunoscuțiproteinele celulare. Nucleazele nu degradează Morfolinos și nici nu sunt degradate în ser sau în celule. Nu există rapoarte publicate despre Morfolinos care să activeze receptori asemănători taxei sau răspunsuri imune înnăscute, cum ar fi inducerea interferonului sau răspunsul inflamator mediat de NF-kB.Nu se știe că morfolinii modifică metilarea ADN-ului.
Morfolinii nu declanșează degradarea moleculelor ARN țintă, spre deosebire de multe tipuri structurale antisens (de exemplu, fosforotioați, siARN). În schimb, Morfolinosact prin „blocare sterică”, legându-se de o secvență țintă într-un ARN, inhibând moleculele care altfel ar putea interacționa cu ARN-ul.
Morfolinos poate modifica, de asemenea, îmbinarea pre-ARNm sau poate inhiba maturarea și activitatea miARN.
Blocaretraducere
legat de regiunea 5 ‘- netradusă a ARN-ului mesager( ARNm), Morfolinii pot interfera cuprogresia complexului de inițiere ribozomală de la capacul 5’ până la codul de pornire. Acest lucru împiedică traducerea regiunii de codificare a transcrierii vizate (numită „dărâmarea”geneiexpresie). Acest lucru este util experimental atunci când un investigator dorește să cunoască funcția unei anumite proteine; Morfolinos oferă un mijloc convenabil de a distruge expresia proteinei și de a învăța cum că knockdown schimbă celulele sau organismul.
modificarea îmbinărilor pre-ARNm
Morfolinopoate interfera cu etapele de procesare pre-ARNm fie prin împiedicarea complexelor mici de ribonucleoproteine nucleare (snRNP) de la legarea la țintele lor la granițele intronilor pe o catenă de pre-ARNm, fie prin blocarea bazei adeninei nucleofile și împiedicarea formării structurii lariatice de îmbinare, fie prin interferența cu legarea proteinelor reglatoare de îmbinare, cum ar fi amortizoarele de zgomot și amplificatorii de îmbinare. Prevenirea legării snRNP U1 (la locul donatorului) sau U2/U5 (la porțiunea de polipirimidină și la locul acceptorului) poate provocasamblare modificată, excluzând în mod obișnuit exonii din ARNm Matur. Direcționarea unor ținte de îmbinare are ca rezultat incluziuni intronice, în timp ce activarea site-urilor de îmbinare criptică poate duce la incluziuni sau excluderi parțiale.Obiectivele snrnp-urilor U11/U12 pot fi, de asemenea, blocate. Modificarea lipirii poate ficonvenabil testată prin reacția în lanț a polimerazei reverstranscriptazei (RT-PCR)și este văzută ca o schimbare de bandă după electroforeza în gel a produselor RT-PCR.
KNOCKOUT
o variație a knockout-ului genetic tradițional este knockout-ul genetic condiționat.
eliminarea condiționată a genelor este o tehnică utilizată pentru a elimina gena aspecifică într-un anumit țesut, cum ar fi ficatul. Această tehnică este utilăpentru a studia rolul genelor individuale în organismele vii. Diferă de eliminarea tradițională a genelor, deoarece vizează gene specifice în anumite momente, mai degrabă decât să fie șterse de la începutul vieții. Folosind tehnica condiționată geneknockout elimină multe dintre efectele secundare ale knockout-ului genetic tradițional. În eliminarea tradițională a genelor, poate apărea moartea embrionară dintr-o mutație genetică, ceea ce împiedică oamenii de știință să studieze gena înadulți. Unele țesuturi nu pot fi studiate în mod corespunzător în mod izolat, astfel încât gena trebuiesă fie inactiv într-un anumit țesut, rămânând activ în altele. Cu astatehnologie, oamenii de știință sunt capabili să elimine genele într-o etapă specifică îndezvoltare și să studieze modul în care knockout-ul unei gene într-un țesut afectează samegena în alte țesuturi.
tehnica cea mai frecvent utilizată este sistemul Cre-loxrecombination. Enzima cre recombinază recunoaște în mod specific douălox (loci de recombinare) site-uri din ADN și provoacă recombinarea între ele. Această recombinare va provoca o ștergere sau inversiune a genelor dintre cele două site-uri lox, în funcție de orientarea lor. Gena Anentire poate fi îndepărtată sau inactivată. Întregul sistem este inductibil, astfel încât acemicul poate fi adăugat pentru a elimina genele la un moment dat. Două dintre cele mai frecvent utilizate substanțe chimice sunt tetraciclina, care activează transcripția genei recombinazei și tamoxifenului, care activează transportul proteinei Crerecombinazei către nucleu. Doar câteva tipuri de celule exprimă Crerecombinaza și nici o celulă de mamifere nu o exprimă, astfel încât nu există riscul activării accidentale a siturilor lox atunci când se utilizează eliminarea condiționată a genelor la mamifere.
un șoarece care conține gena Cre și un șoarece care conține secvențele loxP sunt crescute pentru a genera un knockout condiționat pentru un anumit gen de interes. Șoarecii nu exprimă în mod natural cre recombinază sau loxsites, dar au fost proiectați pentru a exprima aceste produse genetice pentru a crea descendenții dezirabili. Trebuie să obțineți un mouse în care un exon important este floxat (înseamnă că are Alox-P în amonte și în aval) și un mouse care are o secvență Cre a cărei expresie este reglementată de un promotor specific tipului de celulă sau de un promotor inductibil. Apoi traversați acești șoareci și obțineți un șoarece în care celulele care nu exprimă Cre vor avea gena cu o funcție normală, în timp ce celulele care exprimă Cre vor avea o funcție genică perturbată în porțiunea dintre Lox-P.
(Francesca Luca)

mecanismul de interferență ARN

interferența ARN (RNAi), un răspuns antiviral celular antic, este un mecanism natural pentru tăcerea expresiei genei. Poate fi exploatat pentru a permite inhibarea specifică a funcției oricărei gene țintă. RNAi se dovedește a fi un instrument de cercetare neprețuit, ajută la identificarea genelor noi implicate în procesele bolii.

RNAi nu este singurul mecanism de atenuare a expresiei genelor (tabelul 1).

Tabelul 1: Comparațieîntre diferite metode pentru reducerea la tăcere a genelor.

interferența ARN (RNAi) apare ca răspuns la introducerea ARN dublu catenar (dsRNA)într-o celulă. Introducerea dsRna declanșează activareaprotein kinaza-r dependentă de Arnd (PKR). PKR activat fosforilează factorul de inițiere a traducerii EIF2: acest efect, în asociere cu activarea Rnazei-L și inducerea producției de interferon, oprește sinteza proteinelor și promovează apoptoza. În general, se crede că aceasta reprezintă un mecanism antiviral de apărare. Arnaeste un mecanism foarte conservat în întreaga specie taxonomică . Pe lângă faptul că au o activitate antivirală, se crede că RNAi suprimă expresia segmentelor potențial dăunătoare ale genomului, cum ar fi transpozonii, care ar putea destabiliza altfel genomul acționând ca mutageni inserționali.

deși mecanismele sale nu sunt pe deplin elucidate, RNAi reprezintă rezultatul unui proces în mai multe etape(Figura 1). La intrarea în celulă, dsrn-urile lungi suntprimul procesat de enzima RNase III Dicer. Acest dimer funcțional conținehelicază, legare dsRNA și domenii PAZ (rolurile lor nu sunt completelucidate). Dicer produce 21-23 fragmente de nucleotide dsRNA cu două console de capăt 3′, adică siRNAs. RNAi este mediată de complexul de silencing indus de ARN (RISC) care, ghidat de siARN, recunoaște ARNm care conține asecvență omologă cu siARN și scindează ARNm la un sit situat aproximativ în mijlocul regiunii omoloage. Astfel, expresia genică esteîn mod specific inactivat la un nivel post-transcripțional.

În C. elegans, Dicer a fost arătatpentru a interacționa cu proteinele rde. Proteinele rde se leagă de dsRNA lung și se crede că prezintă dsRNA lung la Dicer pentru procesare. Mutanții care afișeazăun grad ridicat de rezistență la RNAi a fost raportat că posedă mutații atrde-1 și RDE-4 loci.

Figura 1: mecanismul Rnainterferenței

apariția ARN-ului doublestranded (ds)într-o celulă (de exemplu, ca o consecință a infecției virale) declanșează un răspuns complex, care include printre alte fenomene (de ex.interferon și consecințele sale) o cascadă de evenimente moleculare cunoscuteca RNAi. În timpul RNAi, enzima celulară Dicer se leagă de dsRNA și se desparte în bucăți scurte de ~ 20 de perechi de nucleotide în lungime cunoscute sub numele de ARN de interferență mică (siARN). Aceste perechi de ARN se leagă de enzima celulară numită complex de tăcere indus de ARN (RISC) care folosește o catenă a siARN pentru a lega molecule de ARN monocatenar (adică ARNm) de secvență complementară. Activitatea nucleeazei RISC degradează apoi ARNm, reducând astfel expresia genei virale. În mod similar, se crede că mecanismul genetic al celulelor toutilizează RNAi pentru a controla expresia ARNm endogen, adăugând astfel un nou strat de reglare post-transcipțională. RNAi poate fi exploatat în setările experimentale pentru a doborî genele țintă de interes cu o tehnologie înaltă și relativ ușoară (a se vedea textul pentru mai multe detalii).

în afară de genesilencing, Arnai ar putea fi implicat în alte fenomene de reglare a genelor.. Se pare că RNAi poate funcționa și prin metilarea citozinelor, precum și prin CpGsequences asociate mai clasic cu metilarea. Dacă secvența țintă împărtășește omologia cu un promotor, se poate produce o tăcere transcripțională viametilare. Mai mult, ARN pare să interacționeze cu domeniile cromatinei, carepoate direcționa în cele din urmă metilarea ADN-ului. Studiile lui C. elegans au arătat că arnai se poate răspândi printre celule prin mecanisme care nu se pot balama pe siRNA.Locusul sistemic cu deficit de interferență ARN (Sid), Sid-1, codifică o proteină conservată cu o secvență peptidică semnal și 11 domenii transmembranare presupuse,sugerând că proteina Sid-1 poate acționa ca un canal pentru dsRNA lung, siARN,sau un semnal legat de RNAi nedescoperit în prezent. Mutanții Sid-1 retaincell-rnai autonom, dar nu reușesc să arate răspândirea RNAi. Rămâne neclar dacă acest RNAi sistemic apare la mamifere, deși este raportată o asemănare puternică între Sid-1 și proteinele umane și de șoarece prezise.

(Justine Floret)

Sursa : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang = „ro-ro” xml:lang=”ro-ro”>

ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

aceste trei tehnologii moleculare permit editarea genomului într-o manieră specifică site-ului, fiecare tehnică cu un mecanism diferit. Nucleazele cu deget de Zinc (ZFN) și nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcriere (TALENs) sunt nucleaze himerice compuse din module programabile, specifice secvenței de legare a ADN-ului legate de un domeniu nespecific de clivaj al ADN-ului. ZFN-urile și Talenele permit o gamă largă de modificări genetice prin inducerea rupturilor ADN cu două catene care stimulează îmbinarea finală non-omoloagă predispusă la erori sau repararea direcționată către omologie în locații genomice specifice.

imagine preluată dinhttp://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

versatilitatea ZFNs și TALENs rezultă din capacitatea de a personaliza domeniul de legare a ADN-ului pentru a recunoaște practic orice secvență. Aceste module de legare a ADN-ului pot fi combinate cu numeroase domenii efectoare pentru a avea impact asupra structurii și funcției genomice, inclusiv nucleaze, activatori transcripționali și represori, recombinaze, transpozaze, ADN histone metiltransferaze și histone acetiltransferaze. Astfel, capacitatea de a executa cu succes modificări genetice depinde în mare măsură de specificitatea și afinitatea legării ADN-ului proteinelor proiectate cu degetul de zinc și TALE.

cys2-his2 proteine deget zinc

domeniul cys2-His2 zinc-deget este printre cele mai frecvente tipuri de motive de legare a ADN-ului găsite în eucariote și reprezintă al doilea domeniu proteic cel mai frecvent codificat din genomul uman. Un deget individual de zinc este format din aproximativ 30 de aminoacizi într-o configurație conservată de la suta. Mai mulți aminoacizi de pe suprafața helixului de la XV intră în contact de obicei cu trei perechi de baze în canelura majoră a ADN-ului, cu niveluri diferite de selectivitate. Structura modulară a proteinelor zinc-deget le-a făcut un cadru atractiv pentru proiectarea proteinelor personalizate de legare a ADN-ului. Cheia aplicării proteinelor zinc-deget pentru recunoașterea specifică a ADN-ului a fost dezvoltarea unor matrice nenaturale care conțin mai mult de trei domenii zinc-deget. Acest avans a fost facilitat de descoperirea pe bază de structură a unei secvențe de linker foarte conservate care a permis construirea proteinelor sintetice cu deget de zinc care au recunoscut secvențele ADN de 9 până la 18 bps în lungime. Deoarece 18 bps de secvență ADN pot conferi specificitate în limita a 68 de miliarde bp de ADN, această metodă a permis ca secvențele specifice să fie vizate în genomul uman pentru prima dată.

efectori de tip activator de transcriere

TALEs sunt proteine naturale din genul bacteriilor patogene din plante Xanthomonas și conțin domenii de legare a ADN-ului compuse dintr-o serie de 33-35 de domenii repetate de aminoacizi care recunosc fiecare un singur bp. Specificitatea poveștii este determinată de doi aminoacizi hipervariabili care sunt cunoscuți sub numele de diresidues cu variabilă repetată (RVD) . La fel ca degetele de zinc, repetările modulare de poveste sunt legate între ele pentru a recunoaște secvențele ADN contigue. Cu toate acestea, spre deosebire de proteinele degetelor de zinc, nu a existat o reinginerie a legăturii dintre repetări necesare pentru a construi tablouri lungi de povești cu capacitatea de a aborda teoretic site-uri unice din genom. Pe lângă rolul lor în facilitarea HDR (recombinare directă omoloagă), nucleazele specifice site-ului permit, de asemenea, generarea rapidă de linii celulare și organisme cu fenotipuri nule; Repararea mediată de nhej a unui DSB indus de nuclează duce la introducerea de mici inserții sau ștergeri la locul vizat, rezultând eliminarea funcției genice prin mutații de schimbare a cadrului.

imagine preluată din http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

distinctă de nucleazele specifice sitului descrise mai sus, sistemul CRISPR (repetări palindromice scurte Interspațiate de reglementare grupate)/Cas asociat CRISPR a apărut recent ca o alternativă potențial facilă și eficientă la ZFNs și TALENs pentru inducerea modificărilor genetice vizate. În bacterii, sistemul CRISPR oferă imunitate dobândită împotriva invadării ADN-ului străin prin scindarea ADN ghidată de ARN. În sistemul CRISPR/Cas de tip II, segmente scurte de ADN străin, denumite „distanțiere”, sunt integrate în locii genomici CRISPR și transcrise și prelucrate în ARN CRISPR scurt (crrna). Aceste crRNAs se recoac la crRNAs trans-Activatoare (tracrRNAs) și scindarea directă specifică secvenței și tăcerea ADN-ului patogen de către proteinele Cas. Lucrările recente au arătat că recunoașterea țintei de către proteina Cas9 necesită o secvență de „semințe” în cadrul crRNA și o secvență conservată de motiv adiacent protospacer care conține dinucleotide (PAM) în amonte de regiunea de legare a crRNA. Sistemul CRISPR / Cas poate fi astfel redirecționat pentru a scinda practic orice secvență de ADN prin reproiectarea crRNA. În mod semnificativ, sistemul CRISPR/Cas s-a dovedit a fi direct portabil la celulele umane prin co-livrarea plasmidelor care exprimă Endonucleaza Cas9 și componentele crRNA necesare.

imagine preluată de la https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php