înaltă fidelitate & enzimă PCR eficientă: kod ADN polimerază
hipertermofilul archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (anterior Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) a fost izolat dintr-un izvor fierbinte solfataric (Fig. 2) la insula Kodakara (Fig. 3) în Japonia, și a fost identificat și caracterizat.
o familie B ADN polimerază (kod ADN polimerază) a fost găsită în această tulpină KOD1 și prezintă diverse proprietăți unice (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (Insula Kodakara, Japonia)
-
Fig. 3. Insula Kodakara (Prefectura Kagoshima, Japonia)
kod ADN polimeraza prezintă o activitate puternică de exonuclează 3 ‘ 5 ‘ (activitate de citire a probelor), o activitate care nu are ADN polimeraza Taq.
mai mult, această enzimă prezintă o capacitate excelentă de procesivitate și alungire, prezentând o rată de extensie de cinci ori mai mare (100-130 nucleotide/secundă) și o procesivitate de 10-15 ori mai mare (>300 baze) decât cea din Pyrococcus furiosus (PFU ADN polimerază). Rata de alungire a acestei enzime este de aproximativ 2 ori mai mare decât cea a ADN polimerazei Taq (Tabelul 1)(Fig. 4) (1).
Tabelul 1. Proprietățile ADN polimerazelor termostabile
| valoarea Proterty | pentru ADN polimeraza indicată | ||
|---|---|---|---|
| KOD ADN polimerază | Pfu ADN polimerază | Taq ADN polimerază | |
| origine | Archaea | Archaea | bacterii |
| masa moleculară dedusă (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| temperatura optima (CENTICC) | 75 | 75 | 75 |
| pH optim la 75 CENTICC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| termostabilitate (timp de înjumătățire) | 95 XLC,12 h; 100oC,3,0 h | 95 XLC, 6h; 100 XLCC, 2,9 h | 95 XLC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Compararea ratelor de alungire a kod PFU și a ADN polimerazei Taq.
rata de alungire a fost măsurată în funcție de lungimea ADN-ului sintetizat, folosind M13 ssDNA ca șablon la 75 UNKTICC.
în paralel cu studiul activităților ADN polimerazei KOD, s-au dezvoltat anticorpi de neutralizare pentru polimerază și activități de corectare (2). Acești anticorpi pot fi aplicați la „tehnologia PCR de pornire la cald” folosind ADN polimerază KOD.
structura 3-D a ADN polimerazei a fost caracterizată în 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. Structura 3-D a ADN polimerazei KOD
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (Cod nr. KOD-201) a fost dezvoltat pe baza ADN polimerazei KOD și prezintă o fidelitate PCR ridicată (Table2).
Tabelul 2. Compararea frecvenței mutației fiecărei enzime PCR.
| baze totale secvențiate | Numărul de baze mutante | frecvența mutației (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu ADN polimerază | 113,080 | 12 | 10.6 |
| enzima Taq-base long-PCR | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq ADN polimerază | 102,708 | 145 | 141.2 |
fidelitatea a fost măsurată ca frecvență de mutație prin secvențierea produsului PCR. După clonarea produsului PCR (2,4 kb din regiunea beta-globinei umane), au fost selectate și secvențiate aproximativ 96 de clone.
KOD FX (Cod nr. KFX-101) a fost dezvoltat pe baza ADN polimerazei KOD și prezintă o rată de succes PCR mult mai mare (bazată pe eficiență și capacități de alungire) decât KOD-Plus- (Cod nr. KOD-201) sau alte enzime PCR bazate pe Taq. KOD FX este, de asemenea, eficient pentru amplificarea din specimene brute (de exemplu, lizat de coadă de șoarece, celule cultivate).
Fig. 6. Amplificare directă dintr-un lizat brut de coadă de șoarece
1,2: KOD FX
3~6: enzimele altor companii
M: markeri
