evaluarea profilului funcțional al Lactobacillus fermentum TCUESC01: o nouă tulpină probiotică potențială izolată în timpul fermentației cacao

rezumat

utilizarea bacteriilor probiotice intestinale este foarte frecventă în industria alimentară și a fost punctul central al majorității cercetărilor din acest domeniu. Cu toate acestea, în ultimii ani, cercetările asupra microorganismelor extraintestinale au crescut foarte mult datorită potențialului lor bine cunoscut ca probiotice. Astfel, am studiat o tulpină de Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extrasă din cacao fermentantă. În primul rând, am examinat impactul pH-ului asupra creșterii acestei tulpini și am studiat supraviețuirea acesteia în condiții similare cu cele ale tractului gastro-intestinal uman. L. fermentum TCUESC01 a demonstrat rezistență la afecțiuni care imită stomacul și intestinele umane și a crescut bine între pH 5 și pH 7. În continuare, am supus L. fermentum TCUESC01 la depozitare la 4 centi C într-o soluție de lapte și am constatat că a supraviețuit bine timp de 28 de zile. În cele din urmă, am măsurat susceptibilitatea acestei tulpini la numeroase antibiotice și tendința sa de autoagregare. L. fermentum TCUESC01 a arătat o autoagregare semnificativă, precum și susceptibilitatea la majoritatea antibioticelor testate. În general, descoperirile noastre susțin utilizarea potențială a acestei bacterii extraintestinale ca probiotic dietetic.

1. Introducere

căutarea de noi probiotice este motivată de cunoașterea faptului că fiecare tulpină de microorganisme posedă proprietăți diferite și ar putea avea efecte unice asupra sănătății umane. Din punct de vedere istoric, se credea că bacteriile lactice din produsele probiotice trebuiau să provină de la oameni datorită specificității gazdei . Cu toate acestea, microorganismele extraintestinale izolate din alimentele fermentate care conțin lactoză sau legumele fermentate prezintă, de asemenea, efecte probiotice promițătoare . Dovezile preliminare din laboratorul nostru indică faptul că tulpinile de Lactobacillus derivate din fermentarea cacao de înaltă calitate prezintă proprietăți probiotice: reduc leziunile histologice, reduc concentrația sistemică a citokinelor inflamatorii și cresc nivelul IgA seric într-un model experimental in vivo de colită . Cu toate acestea, posibila utilizare a acestor tulpini în produsele comerciale depinde de o serie de teste recomandate de organizațiile internaționale. Potrivit Organizației Națiunilor Unite pentru Alimentație și Agricultură (FAO) și Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), tulpinile probiotice potențiale ar trebui evaluate pentru caracteristicile lor funcționale și tehnologice, inclusiv rezistența lor în timpul tranzitului gastro-intestinal și stabilitatea lor în timpul depozitării . Prin urmare, am evaluat proprietățile funcționale și siguranța tulpinii Lactobacillus fermentum TCUESC01 care a fost izolată în timpul fermentării cacao de înaltă calitate.

2. Materiale și metode

2.1. Microorganisme și Condiții de creștere

tulpina Lactobacillus fermentum TCUESC01 (număr de aderare KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) a fost cultivată în bulion lactobacili MRS (1% peptonă, 0,8% extract de carne, 0,4% extract de drojdie, 2% glicoză, 0,5% acetat de sodiu, 0,2% fosfat acid dipotasic, 0,02% sulfat de magneziu heptahidrat, 0.005% tetrahidrat de sulfat de mangan și 0,02% sare de triamoniu de acid citric) (HIMEDIA IX, India) timp de 18 ore la 37 XCT și depozitat la -80 XCT într-o soluție de lapte 10% (Molico XCT, Brazilia) conținând 30% glicerol.

2.2. Analiza creșterii și viabilității sub pH variat

soluțiile de bulion MRS de pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 și pH 9 au fost preparate prin adăugarea a 1 mol·L−1 de acid clorhidric sau 1 mol·L−1 de hidroxid de sodiu. Înainte de studiu, L. fermentum TCUESC01 a fost cultivat timp de 18 ore și apoi diluat într-o soluție salină (0.85% clorură de sodiu) la o densitate optică (OD) de 0,3 măsurată la 600 nm (OD600 = 0,3). Studiile s-au efectuat pe microplăci cu 96 de godeuri (costar hectolitru), în care s-au inoculat 180 il de MRS la fiecare pH cu 20 il de cultură activă sau soluție salină ca martor. Microplaca a fost incubată la 37 CTC, iar OD la 600 nm a fost determinată pe oră timp de 10 ore cu ajutorul unui spectrofotometru (dispozitive moleculare, cititor de microplacă reglabil Versamax). În paralel, s-au prelevat probe la fiecare oră de la fiecare pH, placate cu agar MRS și incubate în condiții anaerobe la 37 centimetric C pentru a testa viabilitatea celulelor.

2.3. Toleranța in Vitro la afecțiunile gastro-intestinale

bacteriile au fost cultivate la 37 de centi C peste noapte în 40 mL de bulion MRS, spălate într-o soluție salină și inoculate în 20 mL dintr-o soluție de lapte 10%. Fermentarea laptelui a fost lăsată să continue până la atingerea unui pH de 4,5, moment în care bacteriile au fost numărate (CFU·mL−1) prin diluare în serie și placare pe agar MRS. În plus, s-a efectuat o diluare în serie într-o soluție salină (pH 2,5) cu pepsină (3 g/L), urmată de incubare la 37 CZC timp de 1,5 ore. Bacteriile au fost spalate prin doua cicluri de centrifugare (5000% g/10 min) si omogenizate intr-o solutie salina, inainte de a fi omogenizate in 20 mL de bila porcina 1% la pH 8,0 (Merck XV, Germania) si incubate la 37% C timp de 45 minute. Numărul de bacterii (CFU * mL-1) s-a determinat prin placarea soluției bacteriene în Agar MRS în condiții anaerobe la 37 CTC timp de 48 de ore după fiecare fază de incubare.

2.4. Supraviețuirea în timpul depozitării la rece în lapte acidulat

tulpina de L. fermentum TCUESC01 a fost cultivată în bulion MRS și apoi recoltată prin centrifugare (5000 g/10 min). Bacteriile au fost apoi spălate prin omogenizare într-o soluție salină și din nou granulate prin centrifugare. Culturile au fost inoculate într-o soluție sterilă de 10% lapte degresat care a fost acidulat până la pH 4,5 cu acid lactic (Synth-ul, Brazilia). Soluția lactică a fost refrigerată la 4 CTC, iar unitățile Formatoare de colonii (CFU·mL−1) au fost numărate prin diluare în serie și placare pe agar MRS la 0, 7, 14, 21 și 28 de zile. Viabilitatea tulpinii a fost determinată în raport cu punctul de timp zero, care a fost considerat a avea o supraviețuire de 100%.

2.5. Analiza Autoagregării

L. fermentum TCUESC01 a fost cultivată în 20 mL de bulion MRS peste noapte la 37 C. peleta bacteriană a fost colectată și omogenizată în soluție salină la o DO de 0,3 la 600 nm (OD600 = 0,3). Capacitatea L. fermentum TCUESC01 pentru autoagregare a fost testată prin incubarea suspensiei la 37 inqc și OD a fost monitorizată pe oră timp de 5 h. agregarea procentuală () a fost calculată după cum urmează: unde este densitatea optică inițială la punctul de timp zero și este densitatea optică la momentul măsurării. Rezultatele prezentate au fost mediile plus / minus abaterile standard de la trei experimente.

2.6. Testarea sensibilității la antibiotice

L. fermentum TCUESC01 a fost cultivată timp de 18 ore în bulion MRS la 37 CTC și diluată la 0,5 pe scara McFarland într-o soluție salină. Discurile antibiotice au fost plasate pe plăci de agar Mueller-Hinton care au fost apoi inoculate cu 100 de centili de suspensie de bacterii active. Plăcile au fost apoi incubate în condiții anaerobe timp de 24 de ore la 37 C. Zonele de inhibare din jurul discurilor au fost măsurate și bacteriile au fost clasificate ca rezistente (), cu sensibilitate moderată (SM) sau sensibile () pe baza standardelor prezentate în tabelul 1. Antibiotic discuri utilizate în testul de susceptibilitate au fost amoxicilină (AMO, LABORCLIN®, Brazilia, 10 µg), ciprofloxacină (CIP, LABORCLIN, Brazilia, 5 µg), amikacina (AMI, CECON®, Brazilia, 30 µg), azitromicina (AZI, CECON, Brazilia, 15 µg), amoxicilină și acid clavulanic (AMC, SENSIFAR®, Brazilia, 30 µg), norfloxacin (NICI, LABORCLIN, Brazilia, 10 µg), sulfonamidele (SUL, NEWPROV®, Brazilia, 300 µg), vancomicină (VAN, SENSIFAR, Brazilia, 30 µg), streptomicină (EST, LABORCLIN, Brazilia, 10 µg), eritromicină (ERI, CECON, Brazilia, 15 µg), tetraciclină (TET, SENSIFAR, Brazilia, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brazilia, 10 µg), cefalotina (CFL, LABORCLIN, Brazilia, 30 µg), gentamicină (GEN, CECON, Brazilia, 10 µg), cefotaxim (CTX, SENSIFAR, Brazilia, 30 µg), cotrimoxazol (trimetoprim și sulfametoxazol) (SUT, SENSIFAR, Brazilia, 25 µg), cloramfenicol (CHEAGURI, SENSIFAR, Brazilia, 30 µg), clindamicina (CLI, CECON, Brazilia, 2 µg), penicilină G (PEN10, CECON, Brazilia, 10 µg), și cefoxitin (CFO, LABORCLIN, Brazilia, 30 µg).

2.7. Analize statistice

calculele mijloacelor și abaterilor standard, analizele varianței, testele multiple de comparație ale lui Tukey și toate analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul programului software Graphpad XV Prism 5.0. Toate graficele au fost, de asemenea, produse folosind programul GraphPad Prism 5.0.

3. Rezultate

3.1. Efectul pH – ului asupra creșterii și viabilității L. fermentum TCUESC01

L. fermentum TCUESC01 a fost capabil să crească în medii la pH 5, pH 6 și pH 7 (Figura 1). Cu toate acestea, creșterea nu a fost observată în afara acestui interval de pH (Figura 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(în)

(f)

(ro)

(h)

(și)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figura 1

creșterea Lactobacillus fermentum TCUESC01 în perioada de la 0 la 10 ore a culturilor la 37 CTC în pH diferit: (a) creșterea MRS fără modificarea pH-ului (pH 6,52); (b) creșterea MRS cu pH 2; (c) creșterea MRS cu pH 3; (d) creșterea MRS cu pH 4; (e) creșterea MRS cu pH 5; (f) creșterea MRS cu pH 6; (g) creșterea MRS cu pH 7; (h) creșterea MRS cu pH 8; (i) creșterea MRS cu pH 9. Fiecare punct al graficului reprezintă media și abaterea standard de la trei experimente.

3.2. Toleranța L. fermentum TCUESC01 la afecțiunile gastrointestinale in Vitro

toleranța L. fermentum TCUESC01 la trecerea gastrointestinală a fost evaluată în condiții concepute pentru a imita tractul gastro-intestinal uman (figura 2). O soluție bacteriană a fost crescută la o concentrație de 8,7 108 cfu·mL−1 într-o soluție de lapte 10%. După depunerea bacteriei la o soluție care conține pepsină la pH 2,5 timp de 1,5 ore pentru a simula sucul gastric, s−a observat o reducere semnificativă statistic () a concentrației bacteriene la 1,23 108 cfu·mL-1. După ce au fost spălate cu soluție salină, bacteriile au fost apoi supuse unei soluții de 1% bilă porcină la pH 8,0 timp de 45 de minute pentru a simula mediul intestinal. În urma acestui tratament, s−a observat o reducere de aproximativ 1 log în numărul de bacterii (3,6 XCT 107 CFU·mL-1). Reducerea numărului de bacterii în timpul incubării în sucul intestinal simulat nu a fost nesemnificativă statistic.

Figura 2

supraviețuirea Lactobacillus fermentum TCUESC01 în timpul trecerii prin tractul gastro-intestinal simulat. „Lapte fermentat” după fermentarea laptelui;” suc de stomac simulat „după trecerea în soluție salină pH 2,5 + pepsină;” suc intestinal simulat ” după trecerea în bilă de bou 1%. Fiecare punct de pe grafic reprezintă deviantul mediu și standard al a trei experimente. Reducere semnificativă statistic () în raport cu ” laptele fermentat.”

3.3. Supraviețuirea L. fermentum TCUESC01 în condiții comerciale de depozitare

pentru a evalua supraviețuirea lor în timpul depozitării, bacteriile L. fermentum au fost refrigerate la 4 CTC timp de 28 de zile într-un lapte altfel steril 10% degresat acidificat la pH 4,5 cu acid lactic (Figura 3). Tulpina bacteriană a fost inițial la o concentrație de 3.6 109 cfu·mL−1, dar după 7 zile de depozitare am observat o reducere semnificativă statistic de aproximativ 1 log în numărul de bacterii. Din ziua 7 până în ziua 21, s−a înregistrat o creștere neașteptată de la 4,3 CTF 108 UFC·mL−1 la 9,0 CTF 108 UFC·mL-1. Până în ziua 28, concentrația bacteriană scăzuse la 2,83 XCT 108 CFU * mL-1.

Figura 3

supraviețuirea Lactobacillus fermentum TCUESC01 în laptele fermentat de la 0 la 28 de zile, la 4 C. fiecare punct reprezintă abaterea medie și standard a trei experimente. „a”: diferență semnificativă statistic în raport cu ziua zero (); „b”: diferență semnificativă statistic în raport cu ziua 14; „c”: diferență semnificativă statistic în raport cu ziua 21.

3.4. Autoagregarea L. fermentum TCUESC01

bacteriile se agregă din ce în ce mai mult până la a cincea oră de cultură in vitro, moment în care s-a observat o agregare maximă de 70,19% 1,78% (Figura 4). Cu toate acestea, creșterile orare ale agregării procentuale au fost semnificative statistic doar până în a treia oră a experimentului ().

Figura 4

procentul de autoagregare a Lactobacillus fermentum TCUESC01 evaluat de la ora 1 până la a 5-A de cultivare în bulionul MRS la 37 ct. C. „a”: diferență semnificativă statistic în raport cu ora 1 de agregare; „b”: diferență semnificativă statistic în raport cu ora 2 de agregare,. Fiecare punct reprezintă abaterea medie și standard a 3 experimente.

3.5. Susceptibilitatea L. fermentum TCUESC01 la antibiotice

această tulpină de L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 a fost susceptibil la amoxicilină, amoxicilină și acid clavulanic, penicilină G, Cefotaximă și cefalotină, aminoglicozide Amikacină și gentamicină, lincosamidă clindamicină, carbapenem imipenem, macrolide azitromicină și eritromicină, fenicol cloramfenicol și tetraciclină. Tulpina a fost, de asemenea, moderat susceptibilă la streptomicină.

4. Discuție

orientări stabilite de FAO și OMS afirmă necesitatea de a analiza proprietățile funcționale și siguranța bacteriilor înainte de a propune utilizarea acesteia într-o matrice alimentară . Am evaluat inițial capacitatea acestei specii de Lactobacili de a crește și de a supraviețui la un pH diferit și, deși a prezentat o creștere numai în intervalul de la pH 5 la pH 7, a rămas viabilă în timpul incubațiilor 10-h la toate nivelurile de pH evaluate, cu excepția pH 2. Studiile au demonstrat o variabilitate largă a pH-ului gastric atunci când stomacul este gol , cu valori medii mai mici decât pH-ul 4 . Mediul intestinal este mai stabil și variază între pH 6 și pH 8, în funcție de regiunea intestinală evaluată . Prin urmare, chiar dacă această bacterie lactică nu a demonstrat capacitatea de a se multiplica sau de a supraviețui sub pH 2,5, rămâne viabilă în intervalul pH-ului intestinal și, prin urmare, poate fi capabilă să funcționeze în acel mediu. În concordanță cu datele noastre, Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ și ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) și Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) izolate dintr-o băutură fermentată consumată în mod obișnuit (Boza) din Peninsula Balcanică au arătat rate bune de creștere în timpul 10 h de incubație între pH 5 și pH 7 . L plantarum 423 izolat din băutura de sorg, L. plantarum 241 izolat din ileonul porcului, L. curvatus DF38 izolat din salam și Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 izolat din secrețiile vaginale umane a arătat, de asemenea, o creștere între pH 5 și pH 6,5 în experimente similare . În general, rezultatele noastre demonstrează că L. fermentum TCUESC01 are o creștere și o rezistență la pH similară cu alte bacterii probiotice extraintestinale potențiale. Mai mult, sensibilitatea tulpinii la niveluri de pH mai mici de 2,5 poate fi depășită prin utilizarea unor metode care protejează bacteriile, cum ar fi microîncapsularea . Rezultatele noastre susțin aplicarea potențială a acestei tulpini ca aditiv probiotic în alimente cu caracteristici distincte acide, de exemplu, brânzeturi, sucuri și lapte fermentat.

mediul gastro-intestinal poate fi ostil pentru multe bacterii; o varietate de factori de stres, cum ar fi aciditatea, enzimele digestive și sărurile biliare, pot influența negativ supraviețuirea lor în timpul tranzitului către intestin . Lactobacilul din acest studiu a arătat o reducere cantitativă discretă, dar a rămas viabil în condiții gastrice și intestinale și a rezistat unei concentrații de bilă de trei ori mai mare decât cea găsită în intestinul uman (0,3%) . Similar cu datele noastre, Kaushik și colab. observat că Lactobacillus plantarum Lp9 a scăzut cu aproximativ 0,5 log de la concentrația sa inițială atunci când este expus la condiții care imită stomacul (pH 2) și 1 log atunci când este expus la condiții care imită intestinul. Într-un alt studiu, L. rhamnosus VT1 / 1 izolat din brânză a arătat o reducere de aproximativ 2 log în concentrație în condiții de pH scăzut (pH 3) și o reducere de 1 Log în concentrație atunci când este incubat la pH 7 în prezența a 2% săruri biliare . Rezultatele noastre sugerează că L. fermentum se poate deplasa prin sistemul gastro−intestinal și poate supraviețui în concentrații peste 107 CFU·g−1 (sau CFU·mL-1), ceea ce studiile anterioare sugerează că ar fi suficient pentru a interacționa și/sau interfera cu mediul gazdă .

matricea alimentară este, de asemenea, un factor care influențează viabilitatea microorganismelor în timpul depozitării lor . În testarea supraviețuirii pe termen lung a L. fermentum TCUESC01 în laptele acidificat, am observat o reducere inițială a numărului de bacterii urmată de o ușoară creștere de la Ziua 7 la ziua 21. Această creștere poate fi explicată prin metabolismul bacterian continuu în soluția lactică, deși la o rată redusă datorită temperaturii scăzute. Donkor și colab. de asemenea, s-a observat o variație cantitativă a bacteriilor probiotice în timpul depozitării la 4 centi C, în special Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus lb1466 care a prezentat o creștere de 1 jurnal din ziua 7 până în ziua 14 de depozitare la rece. Într-un alt studiu, L. plantarum depozitat în lapte fermentat și-a redus semnificativ concentrația celulară cu 1 log în timpul a aproximativ 28 de zile de depozitare la 4 c . Deși L. fermentum a prezentat o scădere de 1 log față de concentrația inițială până în ultima zi de depozitare, concentrația sa a fost peste medie la data de expirare a soluției lactice . În mod similar, pe baza recomandărilor Agenției Naționale pentru monitorizare sanitară (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 ar putea fi introdus în matrici alimentare similare laptelui fermentat și să supraviețuiască în concentrații adecvate până la data de expirare a produsului .

microorganismele cu capacitatea de autoagregare rămân în intestine pentru o perioadă mai lungă de timp și astfel au interacțiuni mai bune cu celulele epiteliale și sistemul imunitar gazdă . Tulpina L. fermentum TCUESC01 a demonstrat o capacitate crescută de autoaggregare în studiul nostru de 5 ore. Acest rezultat este mai mare decât cel raportat de Beganovi XV și colab. , care a demonstrat că L. fermentum A8 a avut 60.9 3.91% autoagregare după 5 ore de incubație sau cea raportată de Bao și colab. , OMS a demonstrat autoagregarea mai mică de 28% pentru 10 tulpini de L. fermentum după o incubație de 20 de ore. Pe baza rezultatelor noastre, L. fermentum se agregă bine și, dacă este ingerat, ar putea persista în mediul intestinal uman pentru perioade lungi de timp.

în cele din urmă, am evaluat susceptibilitatea TCUESC01 la o varietate de antibiotice. Cunoașterea susceptibilității la antibiotice este extrem de importantă atunci când luăm în considerare trei factori importanți: posibilitatea rară de infecție cu lactobacil, riscul transferului orizontal al genelor de rezistență la microbii nativi și asocierea dintre bacteriile probiotice și tratamentul cu antibiotice. L. fermentum TCUESC01 a prezentat susceptibilitate la majoritatea antibioticelor, cu excepția inhibitorilor sintezei acidului nucleic (norfloxacină, ciprofloxacină, sulfonamidă și cotrimoxazol) și a doi inhibitori ai sintezei peretelui celular (vancomicină și cefoxină). Aceste rezultate confirmă datele publicate de Kirtzalidou și colab. pe 74 tulpini de Lactobacillus ssp. izolat din fecalele umane, din care 94.5% tulpini au fost rezistente la Amikacină, toate au fost rezistente la kanamicină și ciprofloxacină, 84,7% dintre tulpini au fost rezistente la vancomicină, 1,6% tulpini au fost rezistente la cefalotină și 8,5% dintre tulpini au fost rezistente la bacitracină. În general, lactobacilii prezintă rezistență intrinsecă la chinolone, trimetoprim, sulfonamide, vancomicină și majoritatea inhibitorilor acidului nucleic, în timp ce prezintă susceptibilitate la inhibitorii sintezei proteinelor, cu excepția aminoglicozidelor . Este demn de remarcat faptul că rezistența la antibiotice observată aici este intrinsecă genului, După cum reiese din studiile publicate, iar transferul orizontal de gene este, prin urmare, neobișnuit. Pe scurt, profilul de rezistență al L. fermentum TCUESC01 susține posibilitatea utilizării împreună cu antibiotice care funcționează prin inhibarea sintezei acidului nucleic.

5. Concluzii

în ciuda faptului că este o tulpină extraintestinală izolată în timpul fermentării cacao, L. fermentum TCUESC01 prezintă un potențial puternic ca probiotic pentru aplicarea în produsele alimentare. Acesta rămâne viabil pe un spectru larg de pH și, prin urmare, este potrivit pentru includerea în diferite tipuri de alimente. Când este depozitat într-un produs lactat refrigerat, acesta menține viabilitatea peste nivelurile recomandate de organizațiile naționale și internaționale recunoscute până la data expirării produsului. În condiții care imită tranzitul gastro-intestinal, acesta supraviețuiește și în cantități suficiente pentru menținerea potențialului probiotic. În ceea ce privește comportamentele sale prezise în intestine, L. fermentum TCUESC01 arată o tendință puternică de autoagregare. În cele din urmă, această tulpină prezintă sensibilitate la antibiotice și profiluri de rezistență care vor permite utilizarea sa alături de terapiile medicamentoase. Luate împreună, aceste caracteristici sugerează că L. fermentum TCUESC01 are un potențial mare ca aditiv alimentar probiotic sigur.

conflicte de interese

autorii declară că nu au conflicte de interese.

mulțumiri

această cercetare a fost susținută de un grant de la funda de Amparo a pesquisa do Estado da Bahia (fapesb). Conselho de Desenvolvimento cient Centfico e Tecnol Centgico (CNPq) și coordina de aperfei Centamento de personnels de niveau superior (capes) au oferit productivitate și burse postuniversitare pentru unii autori.