Factorul de tip Kruppel 2 (KLF2) reglează activarea proinflamatorie a monocitelor

rezultate

expresia KLF2 este redusă cu activarea/diferențierea monocitelor în macrofage.

pentru a înțelege mai bine rolul KLF2 în reglarea celulelor imune, cum ar fi monocitele/macrofagele, am evaluat mai întâi expresia KLF2 în monocitele umane primare. Așa cum se arată în Fig. 1 A stânga, expresia KLF2 este robustă în monocitele umane primare și puternic redusă cu diferențierea în macrofage după 5 zile. Expresia KLF2 în linia celulară monocitară umană THP-1 a fost mult mai mică decât cea din monocitele umane primare. Cu toate acestea, expresia a fost redusă în continuare la tratamentul acestor celule cu LPS sau 12-o-tetradecanoilphorbol-13-acetat, doi agenți bine stabiliți pentru a induce activarea sau diferențierea celulară (Fig. 1 A Dreapta).

apoi am căutat să determinăm dacă expresia KLF2 este reglementată în setarea inflamatorie in vivo. Activarea monocitară este un eveniment fiziopatologic cheie în dezvoltarea aterosclerozei, o afecțiune inflamatorie cronică de grad scăzut, așa că am motivat că expresia KLF2 poate fi redusă la acești pacienți (11). Am examinat un grup de 14 subiecți normali în funcție de vârstă și 14 pacienți cu ateroscleroză extinsă (50% cu antecedente de revascularizare a arterei coronare) care sunt stratificați de cele mai mici și cele mai înalte niveluri ale genei osteosarcomului Finkel-Biskis–Jinkins (FOS), care s–a dovedit a servi drept marker al inflamației (12). Așa cum se arată în Fig. 1 B, expresia KLF2 a fost semnificativ redusă cu 30% la pacienți. În schimb, nu s-a observat niciun efect semnificativ pentru KLF3, KLF6, KLF11 și KLF13. În concordanță cu studiul nostru anterior, expresia FOS a fost semnificativ crescută la pacienții cu boală coronariană (12).

KLF2 inhibă activarea monocitelor și capacitatea fagocitară.

ca răspuns la stimulii inflamatori, monocitele exprimă niveluri crescute de factori proinflamatori și citokine/chemokine și prezintă o capacitate fagocitară sporită. Pentru a obține o perspectivă asupra rolului KLF2 în funcția monocitelor, am întreprins studii de supraexpresie. Celulele THP-1 au fost infectate fie cu virusul gol de control (EV), fie cu KLF2 (Ad-KLF2) timp de 24-48 ore și apoi stimulate cu LPS timp de 2 și 6 ore. așa cum se arată în Fig. 2 A, tratamentul celulelor infectate cu EV cu LPS (25 ng/ml) a dus la o inducție robustă a ciclooxigenazei (COX)-2, factor tisular și proteină chemoatractantă monocitară (MCP)-1 ARNm. În schimb, această inducție a fost atenuată semnificativ în celulele infectate cu KLF2 (Fig. 2 A). Efecte similare au fost observate și la linia celulară monocitară de șoarece J774a (datele nu au fost prezentate). Mai mult, supraexprimarea KLF2 a inhibat puternic secreția diferitelor citokine și chemokine. Așa cum se arată în Fig. 2 B, klf2 supraexpresia a atenuat inducerea mediată de LPS a unor factori precum CD40L (cu 49,6%), proteina inflamatorie macrofage 1 inkt (48,4%), proteina inflamatorie macrofage 1 inkt (64,2%), IL-1 inkt (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-inkt (50,2%) și MCP-1 (68,8%). Acest efect a fost specific, deoarece nu s-a observat niciun efect semnificativ asupra nivelurilor de multipli alți factori de creștere relevanți (TGF Ctf1, factor de creștere derivat din trombocite și factor de stimulare a coloniilor granulocitare/macrofage), citokine/chemokine (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1 și IFN-CTF) sau enzime care modifică matricea (Matrix metaloproteinase tipurile 1, 2, 3 și 9) (datele nu sunt prezentate).

o caracteristică clasică a monocitului/macrofagului activat este fagocitoza. Pentru a determina dacă supraexpresia KLF2 afectează capacitatea fagocitară a monocitelor, am supraexprimat KLF2 sau control (EV) în celulele THP-1, stimulate cu LPS și am evaluat capacitatea acestor celule de a prelua bioparticulele Zymosan a marcate cu roșu Texas. Așa cum se arată în Fig. 2 C, celulele infectate cu virusul de control au ingerat bioparticulele zymosan. În schimb, absorbția de către monocitele care exprimă KLF2 a fost semnificativ redusă (Fig. 2 C). Luate împreună, aceste date demonstrează că KLF2 poate inhiba secreția monocitelor de citokine/chemokine și fagocitoză.

KLF2 nu inhibă recrutarea monocitelor.

în continuare am căutat să evaluăm efectul KLF2 asupra funcției monocitelor in vivo. Ca răspuns la o leziune sau la un stimul inflamator, monocitele sunt recrutate din sânge în țesuturi. Am întreprins mai întâi studii pentru a evalua dacă recrutarea monocitelor a fost modificată de expresia KLF2. Pentru a minimiza contribuția altor tipuri de celule, am folosit șoareci C. B-17-Scid-bej care sunt deficienți în T, B și celule ucigașe naturale. Aceste animale (n = 5 per grup) au fost apoi supuse iradierii totale a corpului și reconstituite cu celule J774a infectate adenoviral fie cu virusul martor (EV), fie cu KLF2 prin injectarea venei cozii (descrise în materiale și metode). Animalele au fost apoi supuse injectării I. p. de tioglicolat (un iritant chimic puternic care induce recrutarea monocitelor), iar numărul de celule GFP pozitive a fost evaluat 48 h mai târziu prin analiza citometrică în flux. Așa cum se arată în Fig. 2 C și D, KLF2 nu a inhibat recrutarea monocitelor GFP + J774a în cavitatea peritoneală. Într-adevăr, am observat reproductibil că animalele transduse KLF2 au prezentat o creștere semnificativă a celulelor GFP+. Aceste date sugerează că KLF2 nu inhibă, ci mai degrabă mărește recrutarea monocitară într-un loc inflamator.

KLF2 inhibă inflamația indusă de caragenan.

după recrutare și migrare în țesuturi, monocitele secretă citokine, chemokine și factori de creștere pentru a perpetua răspunsul inflamator. Așa cum se arată în Fig. 2 B, am observat că supraexpresia KLF2 a atenuat elaborarea mai multor citokine și chemokine. Pentru a determina dacă KLF2 afectează funcția proinflamatorie monocitară, am folosit un model bine stabilit pentru inflamație: injecția de picior indusă de caragenan. S-a demonstrat anterior că injectarea acestei substanțe chimice induce reproductibil un răspuns inflamator caracterizat prin edemul labei (13-15). Șoarecii C. B-17-Scid-bej (n = 4 pe grup) au fost iradiați așa cum este descris mai sus, reconstituiți cu celule martor sau klf2-exprimând j774a și apoi provocați cu injecție de caragenan în picior (descris în materiale și metode). Volumul labei a fost determinat prin utilizarea unui hidropletismometru modificat pentru volume mici (Ugo Basile, Milano). Așa cum se arată în Fig. 2 F, animalele infectate cu EV au prezentat o creștere a volumului labei de 17 XT 1,08 mm3 și 23,3 XT 3,05 mm3 după 1 și, respectiv, 2 h de injecție cu caragenan. În schimb, animalele reconstituite cu celule j774a care exprimă KLF2 au prezentat doar o creștere de 6,25 0,85-mm3 și 7,5 0,95-mm3 a volumului labei la 1 și, respectiv, 2 ore după injectarea caragenanului (Fig. 2 F). În concordanță cu acest efect brut, analiza histologică a labelor a evidențiat o extravazare redusă a fluidului, ceea ce duce la formarea edemelor (Fig. 2 g, săgeți).

efectul eliminării KLF2 asupra expresiei genelor inflamatorii.

pentru a determina importanța KLF2 în expresia genei inflamatorii monocitare, au fost întreprinse, de asemenea, studii de eliminare mediate de ARN interferent mic (siARN). Așa cum se arată în Fig. 2 H, prin comparație cu celulele netratate (martor) și nespecifice tratate cu siARN, eliminarea KLF2 (60% knockdown) în celulele j774a a dus la inducerea genelor inflamatorii, cum ar fi MCP-1 și un efect mai modest asupra nivelurilor de expresie a COX-2 și a factorului tisular. Aceste rezultate au fost verificate și prin analiza PCR în timp real (Fig. 2 I).

KLF2 inhibă activitățile promotorului NF-kB și AP-1.

KLF2 poate inhiba puternic inducția mediată de LPS a MCP-1, COX-2 și a factorului tisular (Fig. 2 A). Inducerea acestor ținte prin stimuli proinflamatori este cunoscută a fi reglementată de căi transcripționale precum NF-kB și AP-1. Am argumentat că, în principiu, KLF2 poate inhiba aceste căi la mai multe niveluri, cum ar fi expresia, legarea ADN-ului sau inducerea activității transcripționale.

ne-am concentrat mai întâi pe NF-kB, având în vedere rolul său central în inflamație. Supraexprimarea KLF2 nu a modificat acumularea nucleară a p65 sau nivelurile nucleare ale IkB kinazei (IKK) si IKKy (Fig. 3 A). Mai mult, supraexpresia KLF2 nu a modificat cinetica fosforilării sau degradării IkB sau a nivelurilor citoplasmatice ale IKKa, IKK inkt și IKKy (Fig. 3 B). În concordanță cu aceste observații, KLF2 nu a afectat legarea NF-kB de ADN. Așa cum se arată în Fig. 3 C, tratamentul celulelor infectate cu virusul de control (EV) cu LPS a indus o singură bandă majoră. Studiile de concurență și supershift au verificat faptul că această bandă reprezintă NF-XV. Un model aproape identic de legare NF-kB a fost observat în celulele klf2-supraexprimare. Pentru a evalua dacă KLF2 poate afecta activarea transcripțională mediată de NF-kB, s-au efectuat teste reporter de gene. Așa cum se arată în Fig. 3 D, transfecția p65 cu o activitate transcripțională indusă de plasmidă reporter de luciferază NF-kB de 11 ori. Această inducție a fost puternic redusă în prezența KLF2, indicând faptul că KLF2 inhibă activitatea transcripțională NF-kB. Efecte similare ale KLF2 au fost observate pentru calea AP-1 (Fig. 5 A-C, care este publicată ca informații justificative pe site-ul web PNAS).

recrutarea factorului asociat COACTIVATORULUI CBP (PCAF) de către KLF2 ca mecanism unificator.

luate împreună, rezultatele din Fig. 3 indică faptul că KLF2 poate inhiba transactivarea mediată de NF-kB independent de efectele asupra legării ADN a acestor factori. Un posibil mecanism este recrutarea de coactivatori critici. De exemplu, legarea optimă NF-kB necesită interacțiunea cu mai mulți coactivatori cheie, cum ar fi coactivatorul receptorului steroid (SRC)-1, PCAF și p300/CBP. KLF2 poate interacționa cu unul sau mai mulți dintre acești factori, îi poate recruta departe de NF-kB și, în consecință, poate reduce activitatea transcripțională mediată de NF-kB.

pentru a determina rolul PCAF în inhibarea mediată de KLF2 a activității transcripționale NF-kB, am efectuat studii de cotransfecție cu PCAF exogen. Transfecția PCAF (dar nu p300; datele nu sunt prezentate) a salvat în mod semnificativ represiunea mediată de KLF2 a concatemerului NF-kB (Fig. 4 A). O salvare parțială a fost observată și asupra capacității KLF2 de a inhiba activitatea transcripțională AP-1 (Fig. 5D). Pentru a determina dacă KLF2 și PCAF interacționează între ele, am efectuat teste de extragere GST și coimmunoprecipitare. Folosind produse transcrise și traduse in vitro, am constatat că KLF2 și PCAF pot interacționa direct într-un sistem fără celule (Fig. 4 B). Pentru a ști dacă PCAF se leagă de KLF2 in vivo, AM supraexprimat KLF2 (marcat cu hemaglutinină) și PCAF (etichetat cu pavilion) în celulele COS-7. Imunoprecipitarea cu un anticorp anti-Pavilion urmată de Western blotting cu un anticorp anti-hemaglutinină a arătat că KLF2 se leagă de PCAF în celule (Fig. 4 C).

pentru a determina dacă mecanismele care stau la baza efectelor observate sunt operative in vivo, am efectuat studii de imunoprecipitare a cromatinei (ChIP). Așa cum era de așteptat, stimularea LPS a celulelor THP-1 a dus la recrutarea p65 și PCAF către promotorul COX-2 (Fig. 4 D). În plus, s-au observat acetilarea concomitentă a HH3 și HH4. Cu toate acestea, în contextul supraexprimării KLF2, recrutarea PCAF și acetilarea histonei sunt ambele puternic atenuate (Fig. 4 D). În concordanță cu testele noastre de schimbare a gelului, nu a fost observat niciun efect semnificativ al KLF2 asupra recrutării p65.