ARN Total a fost extras folosind reactiv de izolare Tripure (Roche).
probele de ARN au fost tratate cu DNaseI fără Rnază și purificate prin utilizarea Mini Kit-ului Rneasy (QIAGEN). ARN-ul rezultat a fost epuizat de ARN ribozomal utilizând Trusa de eliminare a ARNr Ribo-Zero (om/șoarece/șobolan) (epicentru). ARN-ul sărăcit de ARNr a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc cu prima catenă utilizând sistemul de sinteză cu prima catenă supercript-III (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Ulterior, a doua catenă a fost generată prin utilizarea ligazei ADN E. coli( Invitrogen), E. ADN polimeraza coli (Invitrogen) și setul dUTP, dCTP, dATP și dgtp (câte 10 centimoli fiecare, Promega), în al doilea tampon de catenă (Invitrogen). Apoi ADNc au fost tăiate cu Covaris la aproximativ 300bp. După fragmentare, probele au fost purificate cu coloane MinElute (Qiagen). Iar capetele proeminente 3 ‘și 5′ ale fragmentelor au fost reparate folosind T4 ADN polimerază (NEB) și T4 ADN Polinucleotid kinază (NEB) în tampon de ligază ADN T4 (NEB). Apoi, capetele dA au fost generate prin utilizarea fragmentului Klenow (3′->5’ exo-, NEB), în tamponul 2 (NEB). Reacțiile de ligare a adaptorului au fost apoi configurate folosind adaptoare indexate și ligază rapidă (NEB). Produsele au fost utilizate ca șablon pentru tratamentul Ung (Fermentas) și amplificarea PCR folosind ADN polimerază de înaltă fidelitate Phusion (NEB). Bibliotecile au fost vizualizate pe geluri de agaroză de uz General e-Gel 2% (Invitrogen). Bibliotecile cu coduri de bare au fost secvențiate pe o singură bandă a unui Hiseq2500 (Illumina).
