C. poliacrilamida încorporată cu margele fluorescente
așa cum este descris în secțiunea precedentă, substraturile de siliciu s-au dovedit valoroase în măsurarea forțelor exercitate de keratocitele cu mișcare rapidă. Cu toate acestea, aceleași substraturi sunt mult mai puțin utile pentru studierea majorității celulelor mamiferelor. Pentru ca tracțiunile să fie calculate cu exactitate, substratul trebuie reglat pentru a se potrivi cu motilitatea și generarea forței unui anumit tip de celulă. Este dificil să se producă cu precizie un substrat de siliciu de conformitate dorită pentru celulele cu mișcare mai lentă capabile să exercite forțe superioare. Pentru a depăși această limitare, Dembo și Wang (1999) au folosit un substrat de poliacrilamidă încorporat cu margele fluorescente de dimensiuni submicrometrice. Conformitatea substraturilor de poliacrilamidă poate fi reglată chimic prin variația concentrațiilor de monomer și reticulator (Pelham și Wang, 1997). Poliacrilamida oferă mai multe avantaje suplimentare față de substraturile de siliciu. Pe o gamă largă de deformări, prezintă un comportament elastic liniar. De asemenea, poliacrilamida nu este de obicei supusă legării celulare pe cont propriu, fără conjugarea liganzilor specifici de adeziune celulară (Nelson și colab., 2003). Prin urmare, este o schelă perfectă pentru studierea aderenței și comportamentului celular într-un mod controlabil, definit.
metoda de calcul prin care deformările din substrat sunt utilizate pentru a determina tracțiunile exercitate de celulă sunt foarte asemănătoare cu metodele utilizate pe substraturile de siliciu stresate menționate mai sus. Cu toate acestea, utilizarea markerilor fluorescenți a îmbunătățit foarte mult metoda de urmărire și capacitatea de a calcula un câmp precis de tulpină.
Dembo și Wang au publicat mai multe studii folosind tehnica rezultată, microscopia forței de tracțiune, care elucidează mecanismele migrației fibroblastelor. Mai exact, au arătat că lamellipodia celulei furnizează aproape toată forța necesară pentru locomoția înainte (Munevar și colab., 2001a). Rezultatele lor indică faptul că lamellipodium este o entitate mecanică distinctă de restul corpului celular. Interesant este că aceeași diviziune mecanică din interiorul celulei nu pare să existe în celulele transformate h-ras, explicând probabil diferența în comportamentul lor mobil. În plus, Beningo și colab. (2001) a investigat rolul aderențelor focale în reglarea generării tracțiunii și a constatat că dimensiunea aderențelor focale este invers legată de cantitatea de forță generată. Mai mult, distribuția aderențelor nu corespunde bine cu distribuția forțelor de tracțiune. Autorii concluzionează că aceste rezultate pot indica faptul că complexele focale timpurii sunt responsabile pentru forțe propulsive puternice, iar maturarea acestor situri de adeziune are ca rezultat o schimbare în situri de ancorare pasive — o concluzie care a fost discutată pe larg în literatura de specialitate. În plus, Dembo și colegii de muncă au investigat rolurile dinamice pe care aderențele față-versus-spate (Munevar și colab., 2001b), miozina IIb (Lo și colab., 2004), kinaza de adeziune focală (Wang și colab., 2001) și canalele Ca2+ activate prin întindere joacă în migrația fibroblastelor (Munevar și colab., 2004). Folosind microscopia forței de tracțiune, Dembo și colegii săi au făcut progrese semnificative în înțelegerea rolului generării forței în migrația fibroblastelor.
unul dintre cele mai semnificative progrese tehnice care utilizează gelul de poliacrilamidă este capacitatea de a controla în mod fiabil conformitatea substratului celular fără a modifica densitatea ECM. Reglarea conformității substratului a fost un punct de cotitură critic în dezvoltarea microscopiei forței de tracțiune, deoarece a permis investigarea aproape a oricărui tip de celulă și înțelegerea comportamentului celular în funcție de mediul mecanic. Înainte de studiul realizat de Pelham și Wang (1997), majoritatea studiilor care investighează migrația celulară și adeziunea s-au concentrat pe migrația celulară ca răspuns la mediul său chimic solubil (chemotaxie) sau ca răspuns la ligand conjugat cu substratul (haptotaxie). În plus, studiile care implică mediul mecanic al celulei s-au concentrat asupra răspunsului datorat forțelor impuse, cum ar fi stresul de forfecare a fluidului și întinderea mecanică. Cu toate acestea, prin schimbarea rigidității substratului, Pelham și Wang (1997) au creat o schimbare semnificativă în modul în care cercetătorii abordează răspunsul celular și mecanotransducția. Folosind substraturi de poliacrilamidă, Pelham și Wang au menținut densitatea ECM pe substrat constantă, modificând în același timp conformitatea mecanică. Ei au demonstrat că fibroblastele sunt capabile să răspundă activ la conformitatea mecanică a substratului lor. Celulele de pe gelurile mai rigide sunt mai răspândite și migrează mai lent decât celulele de pe gelurile mai conforme. Mai mult, capacitatea celulelor de a simți conformitatea mecanică a substratului lor se reflectă în capacitatea lor de a schimba starea de fosforilare a numeroaselor proteine conținute în structura de adeziune focală. Aderențele focale pe substraturi rigide sunt mai mari, mai alungite și mai stabile, în timp ce aderențele focale pe substraturi mai conforme conțin pp125fak și paxilină mai puțin fosforilate și apar mult mai neregulat. Aceste rezultate au fost primele care sugerează că indicii ECM mecanici pot fi la fel de importanți ca indicii chimici în reglarea aderenței celulare.
de la articolul seminal al lui Pelham și Wang (1997), o serie de studii au investigat efectele conformității asupra comportamentului celular. Lo și colab. (2000) a folosit chimia poliacrilamidei pentru a crea un substrat care conține un pas în rigiditate — o regiune centrală a substratului în care se întâlnesc două substraturi de conformitate diferite. Ei au demonstrat un comportament numit durotaxis, prin care celulele au fost capabile să detecteze în mod activ și să răspundă la modificările conformității substratului. Celulele care migrau pe substratul moale, la lovirea limitei tranziției rigid–moale, ar trece pe substratul rigid, în timp ce celulele de pe substraturile rigide au prezentat tracțiuni mai mari și o zonă mai răspândită și fie au retras, fie au schimbat direcțiile ca răspuns la limita rigid–moale. Mai târziu, Wong și colab. (2003) a investigat capacitatea fibroblastelor de a migra pe hidrogeluri de poliacrilamidă care conțin gradienți de Conformitate, mai degrabă decât un pas, așa cum a făcut Lo și colegii de muncă. Ei au descoperit că celulele musculare netede vasculare tind să migreze mai repede pe substraturi mai moi decât pe substraturi mai rigide (15 kPa vs 25 kPa) și că celulele tind să se acumuleze pe substraturi mai rigide. Mai mult, modelul de migrare pe gelurile compatibile cu gradientul părea să fie îndreptat spre regiunile de gel mai rigide, mai degrabă decât să prezinte modelul tipic de mers aleatoriu caracteristic migrației celulare. Engler și colab. (2004) a investigat în continuare răspunsul celular la gelurile conforme și a arătat că răspunsul este în mare parte mediat de asamblarea citoscheletului actinei. Prin testarea modificărilor în citoschelet, Engler și colegii săi au putut arăta că o ușoară supraexprimare a actinei în celulă poate compensa pierderea răspândirii observată în răspunsurile gelului moale. În plus, Yeung și colab. (2005) a arătat că pragul de sensibilitate pentru detectarea conformității este specific tipului de celulă și că contactele celulă–celulă pot ajuta, de asemenea, la salvarea modificărilor morfologice observate în substraturile moi pentru a semăna mai mult cu morfologia celulelor pe substraturi mai rigide (Yeung și colab., 2005). În general, studiul durotaxisului este încă relativ tânăr și rămân multe de învățat despre modul în care o celulă simte mecanic și răspunde la proprietățile materiale ale substratului și mediului său.
