2.3.4.1 structura
homodimerul apo-sCTLA-4 a fost exprimat ca o proteină de fuziune Fc clivabilă cu trombină în celulele CHO în prezența kifunensinei.23 ca urmare a deglicozilării, homodimerul a produs cristale difractante la distanțele Bragg de 1,8%, cu dimensiunile celulei unitare de a = 43,86%, b = 51,46% și C = 102,85% și grupul spațial P212121 (Ref. 130). Structura a fost rezolvată prin înlocuirea moleculară. Unitatea asimetrică cuprindea un homodimer legat de disulfură, permițând comparații cu complexele sCTLA-4/sB7-1 și sCTLA-4/sB7-2 și cu sCTLA-4 legat de o lipocalină proiectată.131
cei doi monomeri din unitatea asimetrică au fost alcătuiți din domenii sandwich-uri cu topologie AGFCC’ și ABED așa cum a anticipat Metzler și colab.132 o scurtă „tulpină” de opt reziduuri legată de disulfură la Cys122 a legat domeniile IgSF de membrană. În mod neașteptat, cele două jumătăți ale homodimerului apo-CTLA-4 au fost mai puțin asemănătoare între ele decât cu omologii lor complexați, subliniind că legarea nu este însoțită de rearanjări structurale la scară largă (Fig. 2,2 ore). Comparațiile automate de structuri au identificat CD28 și PD-1 ca fiind structurile cele mai asemănătoare cu CTLA-4. Diferențe importante între CTLA – 4 și CD28 au fost: (i) prezența unui nod în catena g a cd28 de la sec28, (ii) modificări ale mărimii buclei, inclusiv buclele extinse AB, BC și CC’ în CTLA-4 și o buclă C”D trunchiată și (iii) legătura H a catenelor C’ și C” sec28 care rezultă din repoziționarea buclei C ‘C” în sec28. O importanță cheie a fost conformația în mare parte identică a secvenței FG loop 99mypppy104 care formează miezul suprafețelor lor de legare a ligandului. Doar o singură moleculă de apă a putut fi găsită în suprafața neobișnuit de uscată de legare a ligandului apo-CTLA-4, în timp ce 228 de ape au fost detectate în altă parte.
după CD28 și PD-1, următoarele structuri cele mai similare cu domeniul Set V CTLA-4 au fost domeniile 215 anticorp sau TCR V, care diferă mai ales doar în lungimi de buclă. Diferența r. m.s. pentru superpoziția CTLA-4 cu cel mai similar domeniu TCR va a fost de 2,09% pentru 102 reziduuri, în contrast cu 2,89% pentru 86 de reziduuri pentru superpoziția cu d1 de CD2. Caracteristici importante comune cu domeniul Va au inclus bucla lungă CC ‘și bulgări conservate în centurile C’ și G, care impun o răsucire pronunțată pe foaia agfcc’. De remarcat în mod special a fost gradul ridicat de conservare a secvenței și conformația Ca în apropierea catenei g XV-bulge, adică GNGTQIYV (CTLA-4) și GDGTQLVV (Va). În CD2 și CTLA-4, buclele erau similare, iar domeniile diferă în măsura în care: (i) în CD2 nu a fost nici o Sec-lipirea ßA și ßB fire, (ii) nu a fost nici o poftă de mâncare de UN’GFCC’ β-foaie în CD2 datorită repoziționare a β-umflături, (iii) poziția C” β-strand în CD2 dar nu CTLA-4-a permis canonică H-lipire și extensia AGFCC ‘C” β-foaie, și (iv) CTLA-4 nu aveau poftă de mâncare în FG buclă prezent în CD2 (și, de asemenea, de exemplu, B7-1). Analiza a cincizeci și două de domenii IgSF cu set V folosind un program de aliniere secvențială a structurii133 a indicat faptul că familia CD28/CTLA-4 cuprinde un subgrup de domenii cu set V distincte de grupările CD8, receptori de antigen și molecule de „aderență”, de exemplu, B7-1 și CD2. În general, a existat o similitudine mai mare a subgrupului CD28/CTLA-4 cu familia receptorilor de antigen, comparativ cu setul de adeziune. Analiza a sugerat că proteinele familiei CD28/CTLA-4 și receptorii antigenului au împărtășit un strămoș comun posibil similar cu PD-1, cele două familii divergând devreme.
Apo-CTLA-4 a cuprins un homodimer cu subunitățile sale adoptând un aranjament care favorizează interacțiunile bivalente ortogonale cu liganzii poziționați pe suprafețele celulare apposing. Comparațiile cu perechile de monomeri CTLA-4 din complexele B7-1 și B7-2106,107 și monomerul din complexul lipocalin131 au evidențiat o flexibilitate de rotație foarte limitată la interfața homodimer și remarcabil de puține, dacă există, modificări atribuibile legării ligandului. Singurele diferențe au fost evidente în complexul B7-2, cu o ușoară repoziționare a buclelor BC și CC’, și a c” catena de la C și buclele vecine, și diferențe conformaționale în catena de la G la C-terminal. Aceste variații locale au fost îndepărtate de situsul de legare a ligandului CTLA-4 și în niciun caz monomerii apo nu au diferit sistematic de toți cei cinci monomeri CTLA-4 complexați. Pozițiile principale ale atomului de lanț ale secvenței 99MYPPPY104 au fost în esență identice.
structurile complexelor formate de CTLA-4 cu B7-1 și B7-2, care nu au fost comparate anterior, au fost destul de diferite.130 substituție în B7-2, de Val28 vs Arg29 în B7-1, a format un buzunar obligatoriu în B7-2 care a fost completat doar parțial de CTLA-4. Acest lucru a asigurat că complexul B7-1/CTLA-4 a prezentat o complementaritate a formei mai bună decât complexul B7-2/CTLA-4. Compensând ușor acest lucru, suprafața îngropată în B7-2 de CTLA-4 a fost ceva mai mare decât cea pentru B7-1. În general, B7-1 a legat CTLA-4 într-o manieră și mai rigidă decât CTLA-4 a angajat B7-1. Legarea B7-2 de CTLA-4 a fost, totuși, mai complexă și a purtat semnul distinctiv al „potrivirii induse.”În CTLA – 4 bound-vs apo-B7–2, a existat o deplasare de 2,3-3,5 centimi a buclei B7-2 FG spre CTLA-4, care a fost inițiată de o rotație de ~ 120 de grade a Phe31 de B7-2 (Ref. 130). Aceasta a produs o interacțiune de stivuire a Phe31 cu Pro102 a secvenței 99MYPPPY104 a CTLA-4.
