Kluyveromyces marxianus dezvoltarea toleranței la etanol în timpul evoluției adaptive cu îmbunătățiri semnificative ale căilor multiple

îmbunătățirea rezistenței la etanol după o evoluție de 100 de zile

haploidul de tip sălbatic tulpina K. marxianus a fost cultivată în mediu cu 6% (v/v) etanol la 30 450 generații (a se vedea metode pentru detalii). În această perioadă s-a înregistrat o creștere continuă a biomasei (măsurată cu OD600 zilnic) (Fig. 1a), indicând supraviețuirea celulelor sub stres etanol poate fi îmbunătățită. La final, am obținut o populație de K. marxianus cu rezistență mult îmbunătățită la etanol (Fig. 1b). Pe tot parcursul, KM se referă la tulpina brută înainte de evoluție, iar KM-100D se referă la populația K. marxianus după evoluția de 100 de zile. Rezistența maximă la etanol pentru KM a fost de 7% (v/v), iar pentru KM-100D, a fost de până la 10% (Fig. 1b). Am comparat profilurile de creștere între KM și KM-100D în medii de cultură cu niveluri diferite de etanol(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / V, Fig. 1c). În absența etanolului, nu a existat nicio diferență semnificativă între tulpini. Diferența lor a crescut odată cu creșterea nivelului de etanol și a atins maximul cu 6% (v/v) etanol în mediile de cultură. În astfel de circumstanțe, după 48 de ore, biomasa KM-100D a fost aproape de două ori mai mare decât cea a KM. Ambele tulpini au prezentat o creștere întârziată în mediu cu 7% etanol și nu au reușit să crească în mediu cu 8% etanol. În plus, KM-100D a arătat, de asemenea, o rată de creștere maximă remarcabilă mai mare decât KM la 6% etanol (fișier suplimentar 1: Figura S1).

evoluția K. marxianus în etanol 6% (v/v). o valoare zilnică OD600 a populației K. marxianus în timpul evoluției. Celulele au fost transferate în fiecare zi și subculturate într-un mediu proaspăt care conține 6% (v/v) etanol, cu același od600 inițial de 0,6. Apoi, după incubarea la 30 de centimetri C într-un agitator orbital timp de 24 de ore, OD600 a fost măsurat pentru a înregistra creșterea celulară. b analiza diluției reperate pentru toleranța etanolului între pre-și post-evoluție. Celulele KM și KM-100D au fost inoculate pe mediu lichid cu etanol la una dintre concentrațiile de gradient: 0, 1, 2,…, 11% (v / v), respectiv, și incubat la 30 centimetric C timp de 3 zile. O suspensie celulară de 10 OD600 din mediul lichid a fost diluată în serie de 5 ori și a fost observată pe o placă YPD și cultivată la 30 centimetric C timp de 2 zile. c profiluri de creștere a KM și KM-100D la diferite concentrații de etanol. Curba roșie este pentru KM-100D, iar cea neagră este pentru KM. În timpul măsurării profilului de creștere, KM și KM-100D au fost ambele efectuate în trei exemplare biologice

analiza ADN sugerează că K. marxianus nu are nicio schimbare de ploidie sau gene critice în timpul evoluției adaptive

pentru a elucida modificările ADN-ului în KM-100D, am efectuat analiza PLOIDIEI ADN și identificarea mutației ADN. În timpul evoluției adaptive, conținutul de ADN al populației K. marxianus are puține modificări (fișier suplimentar 1: Figura S2); astfel, nu a avut loc nicio schimbare ploidică. Prin analiza ADN-seq A KM și KM-100D, care au fost ambele mapate la genomul de referință al K. marxianus DMKU 3-1042 , s-au obținut siturile SNP între KM și KM-100D (fișier suplimentar 2). Dintre cele 57 de SNP identificate, doar 4 situri au fost dominante în populația KM-100D. Trei dintre ele sunt situate în regiunea de codificare a genelor SAN1, YAP1 și KHT2; cealaltă se află la 445 bp în amonte de ERG26. Site-ul 1324 al SAN1 a fost mutat de la C la T și, în consecință, aminoacidul corespunzător a fost transformat din arginină în cisteină. Cu toate acestea, conform analizei Pfam 32.0, această mutație nu se încadrează în niciun domeniu proteic identificat. Atât mutațiile din YAP1, cât și KHT2 sunt mutații sinonime fără modificări ale proteinelor. Constatările de mai sus sugerează că modificările contextului ADN sunt departe de a fi suficiente pentru a susține o astfel de îmbunătățire a fenotipului în KM-100D, iar reprogramarea transcripțională trebuie să contribuie la acest lucru. Prin urmare, am efectuat în continuare analiza ARN-seq.

o recablare globală indusă de evoluția de 100 de zile

pentru a înțelege bine toleranța la etanol, am efectuat o analiză ARN-seq pentru a compara expresiile genetice ale drojdiilor KM și KM-100D care au crescut în medii cu 4% și 6% (v/v) etanol. Pe baza profilurilor de creștere (Fig. 1c), s-a observat că capacitatea de creștere între KM-100D și KM a avut diferența maximă la 48 h; prin urmare, probele la 48 h au fost colectate pentru analiza ARN-seq. Setare / log2ratio / valori 1 și p < 0.05 drept criteriu de definire a genelor semnificative exprimate diferențiat (DE), am efectuat identificarea genelor de în șapte grupe (Fig. 2, notat ca 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, respectiv). În fiecare grup, analiza DE a fost efectuată în funcție de săgeata care indică controlul. Fișierul suplimentar 3 oferă valori de expresie și statistici de Expresie diferențiale ale tuturor genelor. Există o diferență globală de expresie între KM și KM-100D atunci când ambele au crescut într-un mediu fără etanol (Fig. 2 grup①). Drojdiile KM-100D au 1342 de gene cu o expresie mai mare decât cea a drojdiei KM, în timp ce doar 188 de gene au o expresie mai mică. În mediile cu etanol de 4% și 6% (v/v), numărul de gene reglate în KM-100D este mult redus la 415 (grup②) și, respectiv, 453 (grup③). Cu toate acestea, numerele genelor reglate în sus sunt încă mult mai mult decât cele cu expresie mai mică (104 și, respectiv, 182 de gene). Aceste rezultate sugerează că drojdiile KM-100D sunt rewired transcripțional prin activarea unui număr mare de gene. Sugestia a fost susținută în continuare de schimbările de Expresie induse de etanol în drojdiile KM și KM-100D. Sub inducerea etanolului de 4% și 6% (v/v), drojdiile KM au 1452 și 1465 gene reglate în sus (grupuri ② și XNUMX), în timp ce drojdiile KM-100D au doar 631 și 596 gene reglate în sus (grupuri ④ și④), respectiv. În plus, am aplicat heatmap.2 software-ul din pachetul R pentru a grupa genele și grupurile bazate pe valorile log2ratio (fișier suplimentar 1: Figura S3) și a găsit profilul expresiei diferențiale a genei în grupul ① este apropiat de cel al grupului XL. Luate împreună, drojdiile KM-100D au menținut multe caracteristici de Expresie induse de etanol, chiar dacă au crescut într-un mediu fără etanol. Caracteristicile fac ca celula evoluată să fie mai adaptabilă la stimularea ulterioară a etanolului, adică drojdia KM-100D nu trebuie să activeze la fel de multe gene ca KM.

analiza globală a datelor ARN-seq în KM și KM-100D sub stres etanol. În această figură, am compartimentat datele ARN-seq pentru analiza expresiei diferențiale a genelor. KM și KM-100D au fost prezentate în părțile din stânga și respectiv din dreapta, iar concentrațiile de etanol 0%, 4% și 6% (v/v) au fost localizate în rânduri. Datele RNA-seq au fost împărțite în șapte grupe, denumite①,②,③,④,④, meghs, meghs, și ninth. În fiecare grup, o săgeată indică controlul pentru identificarea expresiei diferențiale, iar cifrele roșii denotă numărul genei reglat în sus, în timp ce cele verzi reprezintă numărul reglat în jos

ulterior, în fiecare grup, am efectuat analiza de îmbogățire a ontologiei genetice (GO) pentru genele DE (fișier suplimentar 1: Figura S4) și a constatat că termenii GO îmbogățiți au acoperit o gamă largă de procese fiziologice de bază celulare, inclusiv biogeneza ribozomilor, biosinteza aminoacizilor, repararea ADN-ului, procesarea ARN etc., dar nu este direct relevant pentru rezistența la etanol. Prin urmare, în cele ce urmează, ne-am concentrat în special pe căile puternic asociate cu metabolismul și toleranța etanolului, prin analizarea genelor de asociate (fișier suplimentar 4).

KM-100D utilizare îmbunătățită a etanolului

pentru a facilita ilustrarea graficului, valorile log2ratio ale genelor de implicate (fișier suplimentar 4) au fost împărțite în cinci intervale: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (și mai sus), așa cum se arată în Fig. 3.

posibile căi de consum de etanol în K. marxianus. În această figură, etanolul este consumat atât în citoplasmă (partea superioară), cât și în mitocondrii (partea inferioară). Dreptunghiul albastru-gri denotă gena implicată, iar grupurile①,②,③,④,④, meghs și svetls sunt în conformitate cu definițiile din Fig. 2. Roșu și verde în numărul grupului denotă reglarea în sus și în jos a genei, respectiv. Intensitatea culorii reprezintă gradul de schimbare a expresiei genelor, corespondența culorii și valoarea log2ratio este cuantificată de bara de culoare din colțul din stânga sus al figurii

a fost investigată diferența dintre KM și KM-100D în consumul de etanol. Așa cum este ilustrat în Fig. 3, pot exista două căi pentru consumul direct de etanol și au fost ambele reglementate în KM și KM-100D atunci când s-au confruntat cu etanol (grupuri④,④, ④ și ninth). O modalitate este prin ADH6 citoplasmatic, care catalizează etanolul la acetaldehidă, facilitat de NADP+. Cealaltă este prin ATF1 mitocondrial, care promovează esterificarea etanolului cu ajutorul acetil-CoA. În special, în KM-100D sub stres de etanol (grupuri ④ și④), YGL039W a fost reglat pentru a genera mai mult NADP+ și, prin urmare, poate furniza mai multe coenzime pentru transformarea etanolului în acetaldehidă pentru a reduce toxicitatea etanolului. În mitocondrii, pentru KM expuși în stresul etanolului (grupurile ② și XNUMX), numai C2E1P301 și ADH4 au fost reglate în sus. În timp ce în KM-100D, în timpul procesului de la etanol la aldehidă la acetat, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 și ALD6 au fost toate reglementate (grupul①). Modificările menționate mai sus indică faptul că KM-100D ar putea dobândi o nouă capacitate de a atenua toxicitatea etanolului prin creșterea consumului de etanol. Teoria explică faptul că KM-100D efectuat peste KM în mediu cu etanol.

KM-100D biosinteza îmbunătățită a lipidelor membranei, presiunea anti-osmotică, stresul anti-oxidativ și plierea proteinelor pentru a rezista stresului etanolului

pe lângă faptul că este consumat, etanolul acumulat influențează direct integritatea membranei celulare, modifică presiunea osmotică interioară și exterioară, perturbă conformația proteinelor și induce generarea speciilor reactive de oxigen (ROS), provocând astfel daune grave celulei de drojdie . În cele ce urmează, am analizat genele de în aceste căi pentru daunele cauzate de anti-etanol în K. marxianus (Fig. 4).

o diagramă schematică pentru anti-etanol a provocat daune în K. marxianus. În partea stângă a acestei figuri, etanolul acumulat în mediu impune o presiune osmotică celulei de drojdie și ulterior activează calea receptivă osmotică. În partea de mijloc, etanolul de mediu pătrunde în celulă și perturbă membrana celulară. În partea dreaptă, lipidele membranei celulare sunt sintetizate pentru a fortifica și repara membrana celulară deteriorată. În partea inferioară, etanolul perturbă conformația proteinelor și provoacă stres oxidativ, astfel senzorii și căile de răspuns aferente sunt activate. Numerele și culorile grupului pentru expresia diferențială a genei sunt în concordanță cu cele din Fig. 3

după evoluția bazată pe etanol, calea de răspuns la stresul alcoolului în KM-100D a fost activată. ASR1 , care se translocă de la citoplasmă la nucleu la expunerea la etanol, și ETP1 , care acționează ca o proteină de retenție citoplasmatică cu rol în activarea transcripțională dependentă de etanol a genelor proteinei de șoc termic, au fost atât reglate în KM-100D (grupul①), cât și parțial reglate în km etanol cu care se confruntă (grupurile XII și IX), sugerând chiar și într-un mediu fără etanol, KM-100D poate pregăti căi receptive pentru provocarea etanolului, la fel ca răspunsul KM la etanol.

formarea lipidelor membranare joacă un rol important în menținerea integrității membranei celulare sub stres etanol . Acizii grași nesaturați, componentele cheie în structura membranei celulare, sunt strâns legate de toleranța la etanol . Ilustrat în Fig. 4, de la acetil-CoA la biosinteza acizilor grași nesaturați până la încorporarea în fosfolipide, genele implicate PPT2, FAD2 și TAZ1 au fost toate reglementate în KM-100D (grupul①), sugerând că, după evoluție, KM-100D poate spori deja biosinteza acizilor grași nesaturați pentru a furniza mai multe materii prime pentru biogeneza membranei celulare. Iar reglarea descendentă a genelor ACC1, TSC13, FAS1 în KM expuși în etanol (grupele XII și IX), este în concordanță cu raportul anterior, care poate explica toleranța slabă a etanolului lui K. marxianus înainte de evoluția adaptivă.

un număr mare de gene asociate cu biogeneza lipidică a membranei celulare, inclusiv fosfoglicerida, sfingolipidul și sterolul, au fost exprimate diferențiat sub stresul etanolului (Fig. 4). În special, genele implicate în biosinteza fosfogliceridelor au fost, în general, reglate în KM-100D (grupul①) și în etanolul cu față de KM (grupurile ++ și XNUMX), indicând faptul că fosfoglicerida poate fi componenta majoră a membranei celulare pentru rezistența la etanol. Pentru biosinteza sterolului, multe gene (de exemplu, ERG9 și ERG7) au fost reglate în jos în grupuri ④ și④, iar mai multe gene au fost reglate în sus în grup ③ (de exemplu, ERG25) și grup XL (de exemplu, ERG26), sugerând că biogeneza sterolului poate fi importantă pentru a rezista la etanol ridicat, dar nu și pentru etanol scăzut. În plus, genele CKI1, ERG2 și ERG25, implicate în biosinteza fosfogliceridelor și sterolilor, au fost doar reglate în grupul④; acesta poate fi unul dintre indicii pentru performanța mai bună a KM-100D decât KM în etanol ridicat.

concentrația ridicată de etanol într-un mediu impune stres osmotic asupra celulelor de drojdie . Așa cum se arată în Fig. 4, senzorii osmotici cu membrană plasmatică (SLN1, OPY2 și SHO1) și genele (HOG1, SSK1 și SSK2) implicate în calea receptivă din aval au fost toate reglate în KM expuși în etanol scăzut (grupa++) și reglate individual în KM-100D (grupa①), în etanol cu față KM-100D (grupuri ④ și④) și în KM confruntat cu etanol ridicat (grupa IX). Producția de glicerol este o modalitate majoră pentru S. cerevisiae care rezistă presiunii osmotice . Când KM și KM-100D s-au confruntat cu etanol, majoritatea genelor legate de biogeneza glicerolului au fost reglate în jos. Constatările de mai sus sugerează că înainte și după evoluție, K. marxianus îmbunătățește întotdeauna căile de detectare și transducție a semnalelor de stres osmotic; cu toate acestea, strategia sa de rezistență la stresul osmotic nu se poate baza pe calea de producție a glicerolului, trebuie să existe și alte modalități.

peretele celular oferă o rezistență mecanică suficientă pentru ca celula să reziste la presiunea osmotică , iar calea secretorie nu numai că transportă proteinele peretelui celular spre exterior, ci și transferă lipidele pe membrana plasmatică pentru a fortifica structura membranei; prin urmare, aceste două procese pot fi responsabile de stresul anti-osmotic. Am analizat genele de în calea secretorie și biogeneza peretelui celular (fișier suplimentar 1: Figura S5). Genele implicate în calea secretorie și biogeneza peretelui celular au fost, în general, reglate în KM-100D (grupul①), iar unele dintre ele au fost, de asemenea, reglate în KM expuse în etanol (grupurile ② și xn). Aceasta implică faptul că KM-100D nu numai că a menținut reglarea în sus a căii secretoare pentru KM rezistenți la stresul etanolului, ci și a extins pe scară largă domeniul de activare al căii secretoare pentru a se pregăti pentru atacul cu etanol; prin urmare, îmbunătățirea căii secretoare și formarea peretelui celular poate fi noua strategie KM-100D dezvoltată pentru a suporta stresul osmotic cauzat de etanol. Pe de altă parte, pentru KM și KM-100D expuse în etanol scăzut (grupuri ④ și④), multe gene din calea secretorie au fost ambele reglate în jos, sugerând că activarea căii secretoare poate să nu fie calea necesară pentru ca K. marxianus să răspundă la etanol scăzut.

Pentru împotriva stresului oxidativ declanșat de etanol (Fig. 4), HYR1 , care funcționează ca senzor și traductor al stresului hidroperoxidic, a fost reglat în KM și KM-100D, ambele expuse în etanol ridicat (grupuri ② și X). Factorii de transcripție care răspund la stresul oxidativ SKN7 și STB5 au fost reglați în KM-100D (grupul①) și în KM cu etanol ridicat (grupul IX). Pentru stresul anti-oxidativ, genele implicate în sistemul superoxid dismutazei (de exemplu, MTM1 și PRX1) au fost în general reglate în KM-100D fie expuse în etanol, fie nu (grupuri①, ④ și④). Pentru sistemul de tioredoxină, genele (de ex., MXR1 și TRR1) au fost reglementate în KM și KM-100D ambele cu etanol. Tioredoxina și reductaza sa au fost, de asemenea, raportate pentru a spori toleranța K. marxianus la inhibitori multipli derivați de lignoceluloză . Pentru sistemul de glutaredoxină, genele GRX2 și GLR1 au fost doar reglate în KM-100D expuse în etanol ridicat (grupa④). Pentru biogeneza peroxizomilor, gene precum PEX6 și PEX7 au fost reglate în KM-100D (grupul①), iar alte gene (de exemplu, PEX3 și INP2) au fost reglate în KM și KM-100D atunci când s-au confruntat cu etanol scăzut (grupuri ④ și④). Cele de mai sus implică faptul că KM-100D poate consolida la nivel global capacitatea de oxidare.

pentru a asigura o pliere adecvată a proteinelor sub stres etanol (Fig. 4), factorul de transcripție a șocului de căldură HSF1 a fost reglat în KM și KM-100D cu etanol scăzut (grupuri ④ și④), un număr de gene legate de chaperone (de exemplu, PFD1 și CPR7) au fost reglate în km etanol cu față (grupuri XII și XL), de asemenea, menținut în KM-100D (grup①). Unele gene (de exemplu, CPR4) reglate în jos în etanol cu față KM nu au fost reglate în jos în KM-100D. Prin urmare, KM-100D poate îmbunătăți, în general, plierea proteinelor pentru a oferi un mediu celular mai stabil.

s-a raportat că în S. cerevisiae, acumularea de trehaloză a fost importantă pentru toleranța la etanol, datorită faptului că trehaloza funcționează ca solut compatibil pentru a preveni afluxul de săruri în exces în celulele de drojdie ; între timp, genele implicate în degradarea trehalozei au fost induse și de etanol, pentru a-l regla la concentrația optimă . Pentru K. marxianus (Fig. 4), am constatat că genele care participă la biosinteza și degradarea trehalozei (de ex., NTH1 și TSL1) au fost în mod obișnuit reglate în sus atunci când au fost tratate cu etanol scăzut (grupuri ④ și④), dar nu au fost reglate în sus în metabolismul trehalozei atunci când au fost expuse în etanol ridicat (grupuri ② și xn). Acest lucru sugerează că în K. marxianus, acumularea de trehaloză poate fi o strategie specială pentru a face față etanolului scăzut, dar nu și pentru etanolul ridicat.

expresiile diferențiale ale 15 gene implicate în căile tolerante la etanol de mai sus au fost validate prin analiza RT-qPCR (Fig. 5). Expresiile genelor în grupul ① (Fig. 5a) au fost în general reglementate. Pe de altă parte, reglarea în sus a genelor din grupul ④ (Fig. 5D) și grupul (fig. 5e) nu a fost la fel de mare ca în grupa XII (Fig. 5b) și grupa XII (Fig. 5c). Analiza noastră a confirmat că genele care contribuie la toleranța la etanol sunt activate continuu în KM-100D chiar și după retragerea stresului de etanol. Expresia continuă a genelor ar putea fi utilă pentru a stabili mediul intracelular și pentru a beneficia de creșterea celulelor în stresul viitor.

analiza RT-qPCR pentru expresia diferențială a genelor KM și KM-100D în diferite grupuri. un KM-100D vs. KM atât în mediul fără etanol. Aceasta este pentru analiza genelor DE în grupul①. B KM expus în etanol 4% (v/v) față de KM într-un mediu fără etanol. Acest lucru este pentru grupa XII. c km expus în etanol 6% (v/v) față de KM într-un mediu fără etanol. Aceasta este pentru grupul XL. D KM-100D expus în etanol 4% (v/v) față de KM-100D într-un mediu fără etanol. Aceasta este pentru grupul④. E KM-100D expus în etanol 6% (v/v) față de KM-100D într-un mediu fără etanol. Acest lucru este pentru grupul④. În fiecare eșantion, 18S a fost utilizat ca control intern. ARN Total a fost izolat din celule cultivate la 48 de ore în triplicat biologic

validarea consumului sporit de etanol și a rezistenței la stres multiplu în KM-100D

am verificat creșterea drojdiilor KM și KM-100D în mediu YNB cu diferite surse de carbon (Fig. 6a). Atât drojdiile KM, cât și KM-100D au aceeași capacitate de a utiliza glucoza ca singura sursă de carbon. Cu toate acestea, în prezența etanolului 1% și 2% (v/v) ca sursă unică de carbon, drojdiile KM-100D au crescut mai bine decât drojdiile KM. Rezultatul susține ipoteza noastră menționată mai sus că drojdiile KM-100D au utilizat etanolul mai eficient decât drojdiile KM.

analiza creșterii celulare pe etanol și viabilitatea celulară și fermentarea sub solicitări multiple. un test de creștere celulară de KM și KM-100D pe bază de glucoză sau etanol ca sursă de carbon. O suspensie celulară de 10 OD600 a fost diluată în serie de cinci ori și reperată pe o placă YNB cu glucoză sau etanol ca singură sursă de carbon și cultivată timp de 2 zile, așa cum este ilustrat de-a lungul coloanelor. testul de viabilitate a celulelor B de KM și KM-100D sub stres termic. Temperaturile sunt de 30 Centimetre, 37 Centimetre ,40 Centimetre și 45 Centimetre, test de viabilitate a celulelor C. C în condiții de stres oxidativ. H2O2 a fost utilizat ca stimul de oxidare, iar concentrațiile sale sunt 0%, 0,04%, 0,06% și 0,08%. viabilitatea celulelor D sub presiune osmotică. Sarea înaltă (NaCl) a fost utilizată pentru a provoca presiune osmotică, cu concentrații de 0 m, 0,5 m, 0,6 m și 0.7 M. E randamentul etanolului și utilizarea glucozei în KM și KM-100D în circumstanța de bază. F randamentul etanolului și utilizarea glucozei sub 45 C. g randamentul etanolului și utilizarea glucozei sub 6% (v/v) stresul etanolului. h randamentul etanolului și utilizarea glucozei sub stresul etanolului 8% (v/v). În subfigura b–d, KM și KM-100D se află în primul și respectiv al doilea rând. O suspensie celulară de 10 OD600 a fost diluată în serie de 5 ori și observată pe o placă YPD și cultivată timp de 2 zile. Cu excepția încercării termice cu temperaturi specificate, toate celelalte încercări au fost efectuate la 30 C. În subfigura e-h, axa Y stângă și axa Y dreaptă reprezintă reziduuri de glucoză în mediu (notat în negru) și, respectiv, producția de etanol (notat în albastru

pe de altă parte, pe baza Fig. 4, KM-100D poate dezvolta rezistență la solicitări multiple cauzate de etanol simultan, inclusiv stresul osmotic, stresul oxidativ și stresul termic (pentru proteinele de șoc termic luate ca chaperone pentru plierea proteinelor). Pentru a evalua toleranțele drojdiilor la solicitări multiple, am efectuat testul de viabilitate celulară pentru diferite temperaturi, oxidare și, respectiv, presiuni osmotice (Fig. 6b-d). În situația de bază (și anume, 30 C, 0% H2O2 și 0 M Naci), o diferență de viabilitate lipsește între drojdiile KM și KM-100D. Cu toate acestea, în prezența diferitelor solicitări, drojdiile KM-100D prezintă o viabilitate semnificativ mai bună decât cea a drojdiilor KM. În plus, avantajele sunt mai semnificative, în timp ce tensiunile au devenit mai grave (Fig. 6b-d). Ne-am așteptat ca toleranțele la solicitări multiple să introducă noi caracteristici drojdiilor în producția de etanol.

am investigat în continuare productivitatea etanolului între drojdiile KM și KM-100D sub solicitări multiple. În circumstanțe de bază (30 C și 0% etanol, fig. 6e), drojdiile KM și KM-100D sunt aproape aceleași atât în consumul de glucoză, cât și în producția de etanol. Cu toate acestea, drojdiile KM-100D au prezentat avantaje semnificative în prezența temperaturii ridicate (45 centi C, Fig. 6F) sau mai mult etanol (6% sau 8%, Fig. 6g, h) ; mediul comun sa întâmplat de obicei în stadiul final al fermentației. Am efectuat o analiză RT-qPCR atât pentru drojdiile KM cât și KM-100D fermentate în medii cu 6% etanol la 48 h, 72 h și 120 h (Fig. 7). Majoritatea acestor gene tolerante la etanol au fost reglate în KM-100D comparativ cu în KM, în special în stadiul anterior (48 h) pentru ajustarea inițială la etanol (Fig. 7). Pentru a rezuma, prin reglarea expresiilor genelor tolerante la etanol, drojdiile KM-100D au depășit drojdiile KM în medii stresante, cu randamente crescute de etanol.

analiza RT-qPCR pentru expresiile genelor în KM și KM-100D în timpul fermentației. un KM-100D vs. KM ambele la 48 h în fermentație. B KM-100D vs. KM ambele la 72 h în fermentație. c KM-100D vs. KM ambele la 120 h în fermentație. În fiecare eșantion, 18S a fost utilizat ca control intern. Atât KM, cât și KM-100D au fost cultivate în medii cu 6% etanol. ARN Total a fost izolat din celule cultivate în trei exemplare biologice