discuție
producția observată de niveluri ridicate de activitate a proteazei în timpul culturii continue A K. sedentarius a facilitat purificarea a două proteaze, P1 și P2, care au fost active împotriva azocaseinei, lanțul de insulină de la centi, keratina extrasă din calusul uman și calusul neprelucrat. Caracteristicile generale ale acestor enzime, inclusiv gama substratului, temperatura optimă și pH-ul și sensibilitatea la inhibitorii de protează sugerează că acestea sunt similare din punct de vedere biochimic și sunt susceptibile să aparțină familiei serin proteazelor alcaline. Aceste proteaze sunt produse de o mare varietate de microorganisme și acționează ca endopeptidaze (Rao și colab. 1998).
dacă enzimele pot fi clasificate și ca keratinaze, rămâne totuși o chestiune de dezbatere. Keratinazele, prin definiție, ar trebui să fie capabile să hidrolizeze keratina nativă pură. Cu toate acestea, extracția keratinei poate fi realizată numai prin tratamentul prealabil cu agenți de denaturare pentru a o separa de proteinele non‐keratină. Tratamentele mecanice, cum ar fi măcinarea cu bile, au ca rezultat scindarea legăturilor disulfidice, care fac proteina mai susceptibilă la digestia proteolitică de către proteaze precum tripsina și proteinaza K, care nu sunt clasificate ca keratinaze (Noval și Nickerson 1959). În mod similar, utilizarea substraturilor sterilizate termic în testele de keratinază a fost, de asemenea, criticată, deoarece încălzirea poate provoca denaturarea keratinei.
deși în studiul de față calusul fin măcinat a fost utilizat ca substrat enzimatic, lichidul supernatant de cultură a fost activ împotriva bucăților de calus intact. Prin urmare, chiar dacă cele două proteaze nu sunt strict keratinaze, ele degradează calusul uman in vitro și există unele dovezi că acest lucru se întâmplă și in vivo (Nordstrom și colab. 1987).
proteazele au fost, de asemenea, clasificate ca keratinaze ca urmare a activității lor asupra keratinei reduse, caz în care agenții reducători au fost fie adăugați la amestecul de testare enzimatică, fie utilizați în timpul extracției keratinei. Deși activitatea keratinolitică a unei game de bacterii cutanate a fost studiată utilizând keratina nativă ca substrat, agentul reducător, ditiotreitolul (DTT), a fost inclus în amestecul de testare. De exemplu, atunci când activitatea aparentă a keratinazei din Staphylococcus epidermidis a fost studiată în absența DTT, nu a fost detectată nicio activitate (Mikx și de Jong 1987). În mod similar, o serină protează din keratinele degradate de Candida albicans care au fost extrase din stratul corneum al tălpilor umane cu 8 mol L‐1 uree în Tris−HCl și inqut‐mercaptoetanol (Hattori și colab. 1984). În studiul de față, cheratina hidrolizată P1 și P2 care a fost extrasă din calusul piciorului uman cu uree și mercaptoetanol, dar, important, a fost, de asemenea, capabilă să degradeze calusul netratat.
stratul cornos și calusul uman este o structură complexă și stabilă din care keratina este o componentă majoră. Există 30 de gene umane pentru keratină, dintre care 18 sunt exprimate pe piele (Fuchs 1995). Un rezumat al bazei de date keratin a arătat că fiecare keratină are potențiale site‐uri de clivaj pentru proteaze, iar Asp‐Arg și Gly-ARG sunt cele mai frecvente. Dacă filamentele de keratină sunt inițial rupte în aceste locații, este posibil ca degradarea treptată a acestor unități mai mici să apară la locurile secundare de clivaj, producând o gamă de dimensiuni de fragmente peptidice, așa cum se arată prin analiza atacului de protează asupra keratinelor extrase din calusul uman. Rezultatele prezentate în Fig. 3B indică două pH optima pentru activitatea degradantă a calusului P2. O posibilă explicație este că există două enzime în eșantion. Acest lucru pare puțin probabil, deoarece proba de enzimă utilizată a fost foarte purificată, așa cum arată PAGE cu colorare argintie (vezi Fig. 1, banda 6). Nu poate fi exclusă posibilitatea a două enzime degradante de calus în proba P2 purificată cu o mobilitate foarte similară pe pagină. Cu toate acestea, aceeași probă a fost testată folosind aceleași tampoane cu testul azocazeinei și a fost detectat un singur pH optim la pH 10·2. O explicație alternativă este că interacțiunea complexă a substratului calusului / enzimei la diferite pH-uri este un echilibru al activității enzimatice și modificări conformaționale subtile ale substratului, ceea ce duce la optima dublă a pH-ului.
această investigație a arătat că K. sedentarius produce două proteaze extracelulare care au activitate degradantă a calusului. Au fost determinate informații de bază despre dimensiunile lor moleculare relative, IP-ul lor. Cu toate acestea, studiile cinetice enzimatice convenționale nu au putut fi abordate, deoarece substratul natural utilizat în aceste experimente in vitro a fost un amestec complex de polimeri, insolubili în apă. Activitatea enzimatică crescută a P2 în prezența a 800 mmol 1-1 sare poate fi relevantă pentru supraviețuirea microorganismului pe pielea umană, care are o concentrație de sare în schimbare în funcție de activitatea glandei ecrine determinată de rata de exercițiu a persoanei și de temperaturile mediului. Mecanismul(mecanismele) implicat (e) în efectul clorurii de sodiu nu au fost abordate. Se sugerează provizoriu că clorura de sodiu poate afecta fie structura terțiară a enzimei și a substratului, fie ambele, pentru a îmbunătăți accesul sitului activ al enzimelor la locurile specifice de clivaj ale substratului.
cea mai simplă explicație a rezultatelor observate este că într‐un supernatant de cultură al K. sedentarius există două enzime degradante de calus, serin proteaze, care solubilizează și keratina umană prezentă în calus. Este posibil ca K. sedentarius produce o protează, codificată de o genă, și că activitatea autocatalitică sau altă protează produce două enzime cu greutăți moleculare diferite. Alternativ, există două gene care codifică două enzime independente și strâns legate. Această din urmă ipoteză este susținută de un studiu anterior (Holland și colab. 1992). Probele din cultura continuă de K. sedentarius la starea de echilibru la rate de diluare diferite testate pe pagină și suprapuse cu cazeină au arătat două enzime, una constitutivă și cealaltă detectată la concentrații mari la rate de diluare scăzute. Foarte important, la rate de diluare în apropiere de centimax nu a fost detectat. Determinarea secvenței de aminoacizi n-terminali a polipeptidelor P1 (21 reziduuri) și P2 (15 reziduuri) a arătat că acestea sunt total diferite. Acest rezultat, luat împreună cu informațiile din experimentul culturii continue, ar sugera că enzimele sunt codificate independent.
rezultatele acestei investigații au întărit ipoteza că proteazele specifice ale K. sedentarius pot explica degradarea calusului caracteristic keratolizei fără sâmburi. Dovezile până în prezent sugerează, de asemenea, că sunt implicate două proteaze și că acestea sunt active la pH-ul site-ului pielii, pH 6·3-6·9 (Marshall și colab. 1988). Interpretarea rezultatelor obținute din experimentele in vitro în mediul in vivo poate fi pusă la îndoială, chiar dacă calusul uman a fost utilizat ca substrat. În mod ideal, ar trebui luate biopsii ale pielii umane, inclusiv zone ale pielii normale și fără sâmburi. Prezența și localizarea sau absența proteazelor ar putea fi apoi determinate prin tehnici histologice folosind anticorpi monoclonali ca sonde pentru proteaze și K. sedentarius. Cu toate acestea, aprobarea etică nu ar fi acordată biopsiilor din locația necesară, locul portant al piciorului, de la un număr reprezentativ de persoane. Implicarea lui K. sedentarius în keratitoza fără sâmburi printr-un mecanism de producere a proteazelor care degradează keratina nu a fost dovedită Oficial. Cu toate acestea, nu există dovezi care să respingă ipotezele, iar credibilitatea sa a fost consolidată de rezultatele prezentate aici. Au fost prezentate dovezi in vitro puternice care implică K. sedentarius și enzimele sale extracelulare degradante ale calusului în starea de keratoliză fără sâmburi. La pH-ul normal al pielii și hidratarea suprafeței, producția și activitatea acestor enzime vor fi scăzute, P1 fiind mai activ. În condiții de mediu de ocluzie și pe hygeine slabă, pH-ul pielii se deplasează și ușor peste neutralitate. Aceste condiții favorizează P2. Ambele enzime sunt cel mai probabil enzime de curățare, permițând K. sedentarius să obțină surse de carbon și azot, peptide mici, blocate în polimerul complex rezident și insolubil, keratina. În prezent, reglarea producției acestor enzime este necunoscută, la fel ca și contribuțiile lor relative la degradarea calusului in vivo. În plus față de implicațiile clinice, proteazele keratinolitice au o valoare considerabilă pentru sectorul comercial, deoarece sunt utile într‐o serie de procese industriale, inclusiv degradarea deșeurilor de keratină din industria păsărilor și a pielăriei (Shih 1993; Onifade și colab. 1998). Activitatea keratinolitică ridicată a K. proteazele sedentarius la temperaturi și pH relativ scăzute, comparativ cu multe alte proteaze, prezintă o potențială aplicare a acestor enzime în industria biotehnologică.
