Întreținerea și stocurile de pește zebră: peștele zebră (Danio rerio) a fost crescut și pus în scenă conform protocoalelor stabilite30.Liniile transgenice utilizate au fost Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, TG(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, TG(fli1:GAL4FF)ubs37, TG(UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, tgbac(pdgfrb:GFP)ncv2236 și TG (kdrl:EGFP)s84337. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Filiala Riken Kobe (IACUC).
plasmide și oligonucleotide: peștele zebră marcksl1a, marcksl1b și fscn1a au fost clonate prin PCR din ADNc a 1 embrioni dpf utilizând trusa de clonare NEB. Toate construcțiile de Expresie utilizate în acest studiu au fost generate prin clonarea gateway-ului și/sau clonarea in-Fusion-ului folosind plasmide de la Tol2Kit38. Plasmidele cu Marcksl1a și Marcksl1b mutante au fost generate utilizând kitul de mutageneză direcționat pe site-ul Q5 (NEB). vectorii care conțin shRNA au fost construiți prin ligarea secvenței shRNA între site-urile EcoRI și PmeI în aval de promotorul U6 al vectorului pEGFP-U6 modificat39 (un cadou de la Zuoshang Xu, plasmida Addgene #19799). Secvența țintă pentru marcksl1 uman este 5 ‘- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. Secvența shRNA scrambled 5′-GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‘ a fost concepută ca o secvență nepotrivită (subliniată) a MARCKSL1 shRNA. Vectorii care conțin mouse-ul Marcksl1, Marcksl1-s120a/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) și Marcksl1-s120d/T148D / T183D (Marcksl1-DDD) subclonate în pEGFP-N1 (Clontech)10 au fost Cadouri de la Eleanor T. Coffey (Universitatea din Turku). O informație detaliată privind plasmidele și primerii utilizați în acest studiu poate fi găsită în tabelele suplimentare 1 și respectiv 2.
izolarea ARN și sinteza ADNc: ARN-ul Total a fost izolat folosind tri Reactiv (epigenetică) și kitul MicroPrep ARN direct-zolTM (Zymo Research), iar ADNc a fost sintetizat folosind sistemul de sinteză cu primul fir SuperScript III (Invitrogen) conform protocoalelor producătorului.
expresia mozaică a constructelor și a liniilor transgenice de pește zebră: Construcțiile de expresie bazate pe Tol2 (5-10 pg) au fost injectate co-în embrioni de pește zebră cu o singură celulă cu 50 pg de ARNm Transpozază Tol2 transcrise din vectorul pcs-TP NotI-linearizat (un cadou de la Koichi Kawakami, Institutul Național de genetică, Japonia) folosind kitul MMESSAGE mMACHINE SP6 (Invitrogen). Pentru expresia mozaică a transgenelor, embrionii au fost analizați la 1 sau 2 dpf după injecții. Pentru a genera linii Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 și TG(fli1ep:EGFP-PLC1 Xvph)Rk26, embrionii injectați au fost crescuți la adulți și examinați pentru fondatori.
generarea de mutanți marcksl1a și marcksl1b de pește zebră: mutanții marcksl1a au fost generați de mutageneza mediată de CRISPR/Cas9. Un ARN cu un singur ghid (sgRNA) care vizează al doilea exon (suplimentar Fig. 4a) a fost generat prin utilizarea protocolului independent de clonare40. Complexul Cas9 / sgrna RNP a fost asamblat chiar înainte de injectare și după 5 minute de incubare la temperatura camerei, 200 pg de proteină Cas9 (Invitrogen) și 100 pg de sgRNA au fost co-injectate în embrion TG cu o singură celulă(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mcherry)s916. mutanții marcksl1b au fost generați de mutageneza mediată de TALEN. TALEN vizând primul exon al marcksl1b (Fig suplimentar. 4b) a fost proiectat folosind Tal efector nucleotidă Targeter 2.0 (https:/ /tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) și au fost asamblate prin metoda Golden Gate 41. Di-reziduurile variabile repetate TALEN (RVD) au fost clonate într-un vector Rciscript-GoldyTALEN (Addgene) și ARNm plafonate pentru fiecare Talen au fost transcrise in vitro din plasmide de Expresie Saciliniarizate folosind kit mMESSAGE mMACHINE T3 (Invitrogen). Etapa cu o singură celulă Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:ras-mcherry) s916 embrionii au fost microinjectați cu 200 pg de ARN (100 pg din fiecare ARNm TALEN stâng și drept). Fondatorii F0 au fost identificați prin depășirea TALEN sau CRISPR / Cas9-pește injectat cu pește de tip sălbatic și screening-ul descendenților pentru mutații la 2 dpf folosind testul de endonuclează i (NEB) T7 (pentru peștii injectați cu TALEN) sau secvențierea Sanger (pentru peștii injectați cu CRISPR/Cas9). Pe scurt, ADN-ul genomic a fost izolat din grupuri de cinci embrioni folosind metoda Hotshot42 și regiunile genomice corespunzătoare au fost amplificate. Mutațiile au fost evaluate prin secvențierea directă a produselor PCR purificate. Descendenții F1 ai F0 pozitivi au fost crescuți la maturitate, iar purtătorii heterozigoți pentru mutații au fost identificați prin tăierea fină și analiza PCR de genotipare de rutină folosind aceiași primeri.
șase alele mutante în marcksl1a și cinci alele mutante în marcksl1b au fost identificate în timpul screeningului (Fig suplimentar. 13). Alela rk23 adăpostește o deleție 2-nt care duce la o schimbare a cadrului după aminoacidul 51 și codonul de oprire prematură la aminoacidul 56 după 5 aminoacizi missense (suplimentar Fig. 4a, c). Alela rk24 adăpostește o ștergere 5-nt care duce la o schimbare a cadrului după aminoacidul 13 și codonul de oprire prematură la aminoacidul 17 după 4 aminoacizi missense (suplimentar Fig. 4b, d). Din aceste motive, considerăm că marcksl1ark23 și marcksl1brk24 sunt alele nule și ne-am concentrat investigațiile asupra analizelor acestor mutanți.
imagistică Live: embrionii au fost montați în 0,8% agaroză slab topită (Bio-Rad) în mediu E3 conținând 0,16 mg/mL Tricaină și 0,003% feniltiouree. Stivele confocale Z au fost achiziționate folosind un microscop confocal cu disc de filare Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1 inversat echipat cu o cameră Zyla 4.2 CMOS (Andor). Imaginile cu câmp luminos au fost achiziționate pe microscopul Leica M205FA. Imaginile au fost procesate folosind Fiji (NIH).
ablația Laser: ablațiile Laser au fost efectuate folosind un laser de 405 nm (Andor) și modulul FRAPPA (Andor) montate pe un microscop confocal Olympus ix83/Yokogawa CSU-W1 inversat cu un obiectiv de imersie în apă Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2. Au fost aplicate trei ablații laser secvențiale cu un timp de staționare de 1000 de centimetrii fiecare la o putere laser de 51%.
Microangiografie: Microangiografia a fost efectuată în embrioni de tip sălbatic, marcksl1ark23, marcksl1brk24 și marcksl1ark23;marcksl1brk24. În total, 2 și 3 embrioni dpf au fost injectați cu 1-2 nl dextran tetrametil rodamină sau dextran fluoresceină (MW = 2000 kDa, Invitrogen) la 10 mg/mL și au fost fotografiați imediat. Confocal z-stive au fost achiziționate cu un obiectiv Olympus UPLSAPO 10/Na 0.4. Pentru a acoperi întregul embrion, mai multe regiuni au fost imaginate și cusute folosind pluginul de cusătură din Fiji43.
transplant de celule: grupuri de 15-25 celule donatoare din marcksl1ark23;marcksl1brk24 embrioni mutanți în Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 au fost colectate dintr–o poziție aleatorie în blastoderm și transplantate în zona marginală laterală în blastoderm44 de embrioni primitori de tip sălbatic la 4,5-6 hpf. Extracția și transplantul au fost efectuate cu ajutorul unui microinjector de ulei celltram 4R (Eppendorf) cu un capilar din sticlă borosilicată GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) realizat cu un dispozitiv de extragere orizontală cu micropipetă P-87 (Sutter Instrument Co.) și un microforge MF-900 (Narishige) pentru a obține un vârf neted în formă de lingură. În timpul transplantului, embrionii au fost păstrați în vase petri acoperite cu agaroză cu tampon 0,5 X E2 . La 2 dpf, embrionii cu ISV-uri mcherry pozitive au fost selectați pentru microangiografie și imagistică. Au fost efectuate opt transplanturi independente.
tratamente chimice: Latrunculina B (Merck Millipore) a fost dizolvată în DMSO la 1 mg/ml și depozitată la -20 C. ck666 (SIGMA) a fost dizolvată în DMSO la 50 mM și depozitată la 4 C. toți compușii au fost diluați la concentrația dorită în tamponul E3.
transfecție, experiment de eliminare a proteinelor mediate de siRNA și stres de forfecare: HUVECs (Lonza, C-2519a) au fost cultivate în mediu EGM (Lonza) și utilizate până la trecerea 4. Pentru transfecțiile plasmidice, celulele au fost însămânțate în mediu Opti-mem (Gibco) la 5,8 104 celule/cm2 pe poli-L-lizină și învelișuri acoperite cu gelatină și transfectate cu 2 hectolitri de plasmidă utilizând Lipofectamina 3000 (ThermoFisher Scientific). La două ore după transfecție, mediul Opti-MEM a fost schimbat în mediu EGM fără antibiotice. Pentru transfecția siRNA, HUVECs (7.9 104 celule / cm2) au fost transfectate cu siRNA de 20 nM folosind reactivul DharmaFECT1 (Dharmacon). Transfecția a fost repetată după 24 de ore. celulele au fost crescute pentru încă 24 de ore înainte de extracția sau fixarea totală a ARN. ON-TARGETplus umane MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) a fost folosit pentru a knockdown MARCKSL1. On-TARGETplus non-target pool (Dharmacon) a fost utilizat ca transfecție de control siARN. Celulele au fost fixate cu 4% PFA/ PBS, permeabilizate cu 0,1% Triton X-100 și colorate cu 14 mm dapi pentru etichetarea nucleelor, Alexa 568-faloidină (1:1000, ThermoFisher Scientific) pentru vizualizarea F-actinei și anticorp anti-ve-cadherin (1:100, semnalizare celulară) urmat de anticorp secundar anti-iepure Alexa 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific) pentru a marca joncțiunile ce.
pentru experimentele de stres la forfecare, HPAEC (Lonza) au fost cultivate la 1000-1500 celule/mm2 pe 1% vas acoperit cu gelatină în mediu EGM-2 (LONZA) și utilizate înainte de trecerea 9. Celulele au fost expuse la stres de forfecare static sau laminar la 15 dyn / cm2 timp de 0,5, 1 sau 6 ore folosind un aparat de tip placă paralel45,46. O parte a camerei de curgere consta dintr-o placă de sticlă acoperită cu gelatină de 1% pe care se odihneau Hpaec-urile cultivate, iar cealaltă parte consta dintr-o placă din policarbonat. Suprafețele lor plane au fost ținute la o distanță de 200 de centimetri cu o garnitură de Teflon. Camera a fost prevăzută cu o intrare și o ieșire pentru fluid, iar intrarea a fost conectată la un rezervor superior cu un tub de silicon. Ieșirea era deschisă spre un rezervor inferior. Debitul a fost acționat de o pompă cu role/tub. Fluidul (mediu EGM-2) a trecut din rezervorul superior prin camera de curgere în rezervorul inferior. Debitul a fost monitorizat cu un debitmetru ultrasonic de tranzit (HT107, sisteme Transonice) plasat la intrare și a fost controlat prin schimbarea diferenței de înălțime dintre rezervorul superior și ieșirea camerei de curgere. Intensitatea solicitării de forfecare (XV, dynes/cm2) care acționează asupra stratului ce a fost calculată cu ajutorul formulei XV = 6 xktsq/A2B, unde XTX este vâscozitatea perfuzatului (poise), Q este volumul de curgere (ml/s), iar a și b sunt dimensiunile secțiunii transversale a căii de curgere (cm). După expunerea la stres de forfecare, ARN-ul total a fost izolat pentru qPCR.
PCR cantitativ în timp real: qPCR a fost realizat folosind 1 ilqtl din ADNc, generat din 150 ng (HPAECs) sau 500 ng (Huvecs) de ARN total, într-un amestec de reacție de 10 ilqtl conținând 1 x Luna universal qPCR Master Mix (NEB) și 400 nM primeri înainte și înapoi. Reacțiile au fost rulate pe instrumentul ABI Prism 7900ht în patru exemplare. Datele au fost analizate cu ajutorul software−ului RQ Manager (Applied Biosystems), iar expresia relativă a ARNm MARCKSL1 a fost calculată cu Metoda 2-Centictct47 folosind gapdh ca genă de referință.
hibridizare integrală in situ: Hibridizarea integrală in situ a fost efectuată în conformitate cu protocolul standard48. Embrionii au fost fixați în 4% PFA la 24, 48 și 72 hpf și permeabilizați cu 10 hectogg/mL proteinază K. hibridizarea s-a efectuat în tampon conținând 5% dextran sulfat de sodiu (MW = 500 kDa) la 70 CTC peste noapte. După spălarea cu strictețe, exemplarele au fost blocate cu reactiv de blocare 2% (Roche) în tampon de acid maleic și incubate peste noapte cu anticorp anti-digoxigenină (DIG), conjugat cu fosfatază alcalină (Roche, 1:5000) la 4 C. embrionii au fost colorați cu soluție NBT/BCIP (Roche) în tampon de colorare . Embrionii au fost eliminați în 70% glicerol peste noapte și au fost fotografiați folosind microscopul Leica M205FA. Riboprobele lungi marcksl1a și marcksl1b etichetate cu diguri de 1,2 kb au fost generate din plasmide care codifică CDN-urile de lungime întreagă folosind kituri MEGAscript SP6 sau T7 (Invitrogen).
secvențierea ARN cu o singură celulă: ECs au fost izolate din embrioni transgenici Tg(kdrl:EGFP)s843. Sortarea celulelor a fost efectuată cu Facsariaii Cell Sorter (bd Bioscience). Suspensia cu o singură celulă a fost încărcată în sistemul 10x Chromium și bibliotecile ADNc au fost construite folosind Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library și gel Bead Kit V2 (10x Genomics) conform protocolului producătorului. Biblioteca a fost secvențiată pe secvența Illumina HiSeq 1500 (Illumina, SUA). Cell Ranger v2.1 a fost folosit pentru a de-multiplex raw base call (BCL) fișiere generate de Illumina sequencers în fișiere FASTQ, efectuați alinierea, numărarea codurilor de bare și numărarea UMI. Citirile de secvențiere au fost mapate la ansamblul genomului zebrafish (GRCz11, Ensembl release 92). Au fost efectuate analize suplimentare utilizând Seurat package49 în software-ul R (https://www.r-project.org). Matricile de Expresie au fost mai întâi filtrate prin păstrarea genelor care sunt exprimate într-un minim de 3 celule și celule care au exprimat un minim de 200 de gene pentru analiza în aval. Celulele au fost filtrate ulterior prin selectarea celulelor care exprimă conținut mitocondrial scăzut (<7%). Datele au fost apoi normalizate folosind funcția NormalizedData care normalizează expresia genelor pentru fiecare celulă prin expresia totală.
cuantificarea diametrului vasului de sânge: Tg viu (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transgenice wildtype sau marcksl1 embrioni mutanți au fost imaginate la 50-52 hpf. Confocal z-stive au fost achiziționate cu un obiectiv de imersie în ulei siliconic Olympus UPLSAPO 40/NA1.25. Pentru calculul diametrului DA și PCV s-au efectuat 4-5 măsurători între ISV de-a lungul extensiei gălbenușului (ISV nr. 10-14). Pentru diametrul ISV, s-au efectuat în medie 6 măsurători de-a lungul fiecărui ISV (ISV nr. 10-14) între DA și DLAV. Măsurătorile au fost efectuate folosind Fiji (NIH).
cuantificarea numărului ce și a proliferării: Pentru a număra numărul ce, 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 sau marcksl1ark23;marcksl1brk24 embrioni în Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 fundal au fost fixate în 4% PFA și colorate cu 3 dapi de la unqqm. Stivele confocale Z au fost achiziționate cu un obiectiv de imersie în ulei siliconic Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Nucleele au fost numărate în fiecare ISV (ISV nr. 9-22) între DA și DLAV. Pentru a cuantifica ECs mitotice în ISVs, wildtype sau marcksl1ark23;marcksl1brk24 embrioni în Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mcherry) s916 fundal au fost fixate în 4% PFA la 30, 36 și 48 hpf, permeabilizată în 1% DMSO / 1% Triton X-100 și colorate cu anticorp anti-fosfo H3 (1:250, Merck Millipore), urmat de anti-iepure Alexa 488 anticorp secundar (1:1000, ThermoFisher științific) și 3 dapi. Stivele confocale Z au fost achiziționate cu un obiectiv de imersie în ulei siliconic Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Celulele mitotice (celule pH3-pozitive) au fost numărate în ISV-uri pe ambele părți ale embrionului (ISV-uri nr. 9-22). ISV – urile au fost vizualizate folosind fluorescența mCherry. Doar o celulă pH3-pozitivă per ISV a fost detectată indiferent de poziția ISV. În timpul numărării, am considerat EC în telofază ca o singură celulă. Pentru a număra numărul de diviziuni ce, embrionii wildtype sau marcksl1ark23;marcksl1brk24 din Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mCherry)s916 au fost fotografiați de la 24 la 48 hpf la intervale de 6 minute folosind un obiectiv de imersie în ulei siliconic Olympus UPLSAPO 30 October/NA 1.05. Numărul diviziunilor celulare din fiecare ISV (ISV nr.11-15) a fost cuantificat.
cuantificarea nivelurilor de actomiozină în cortexul apical: Tg viu (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; TG(fli1ep:EGFP-plc Xv1ph)Rk26 și Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; TG (kdr-l:ras-mCherry)s916 embrionii de pește zebră au fost fotografiați la 30-34 hpf folosind un obiectiv de imersie în apă Olympus UPLSAPO 60/NA 1.2. Intensitatea Lifeact sau Myl9b de-a lungul cortexului apical și în citoplasmă a fost măsurată folosind Fiji. S-a calculat raportul dintre intensitatea medie corticală și cea citoplasmatică.
analiza formei celulare in vivo: etichetarea cu o singură celulă a ECs în ISVs a fost realizată prin expresia mozaică fie a fli1ep: plasmida lynEGFP în wildtype, marcksl1brk24 sau marcksl1ark23;marcksl1brk24 embrioni mutanți sau fli1ep:marcksl1b-egfp plasmidă în embrioni de tip sălbatic. La 2 dpf, s-a efectuat microangiografia și s-au fotografiat vasele cu un obiectiv de imersie în apă Olympus UPLSAPO 60/NA 1.2 cu un interval de planuri Z optice de 0.25 mm. Analiza formei celulare a ECs a ISV-urilor a fost realizată într-o manieră semi-automată folosind un script ImageJ scris personalizat dezvoltat în Python, extinzând metoda descrisă în ref. 50. Imaginile au fost mai întâi decupate grosolan pentru a reduce cerințele de memorie din aval și au fost populate metadate suplimentare (tipul navei și identificatorul embrionului). Un script separat a fost apoi rulat pentru a proiecta și desface celulele din jurul unui vas pe o suprafață 2D. Pe scurt, imaginile decupate au fost mai întâi rotite în funcție de tipul vasului pentru a alinia grosolan axa vasului cu direcția Z într-o stivă de imagini, iar canalul etichetei celulei mozaice fluorescente a fost selectat pentru proiecție. Pentru a depăși problemele cu segmentarea automată a vaselor în canalul de fluorescență al bazinului sanguin cauzate de structurile de fundal fluorescente variabile și perfuzia dextran-rodamină în afara vasului, axa vasului a fost identificată prin definirea manuală a poziției vasului aproximativ la fiecare 10 mm prin stiva de imagini și apoi efectuarea unei potriviri și interpolare a splinei Catmull-Rom. Datele au fost apoi transformate pentru a îndrepta axa navei în trei dimensiuni. În continuare, poziția intensității maxime în canalul de proiecție a fost identificată de-a lungul razelor la intervale de 1 centimetru în jurul axei navei. Aceste informații au fost utilizate pentru a proiecta intensitatea fluorescenței pe un plan în care axele sunt poziția de-a lungul axei navei și poziția unghiulară și pentru a cartografia distanța de la axa navei la fiecare poziție de pe planul proiectat. Celula a fost identificată din imaginea proiectată folosind metoda Intermodes încorporată a ImageJ. Lungimile arcului reprezentate de laturile fiecărui pixel asociat celulei au fost apoi calculate (\(l = \ frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), unde r este distanța dintre pixelul asociat celulei și axa vasului și d este latura unui pixel) și utilizat pentru a genera măsuri ale suprafeței celulei și ale raportului de aspect.
analiza in vitro a formei celulare: Huvec-urile fixe au fost imaginate cu un obiectiv de imersie în ulei siliconic Olympus UPLSAPO 40/NA 1.25. În total, 10-20 de imagini din fiecare alunecare de copertă au fost luate pentru cuantificare și analizate într-un mod semi-automatizat folosind un script ImageJ scris la comandă. Stivele Z cu mai multe canale au fost proiectate maxim și canalul care prezintă un marker GFP a fost identificat din metadatele instrumentului. Metoda de prag Otsu încorporată ImageJ a fost utilizată pentru a separa celulele de interes de fundal; Imaginile binare rezultate au fost curățate prin îndepărtarea regiunilor mai mici de 105 mm2 și a regiunilor în contact cu limita câmpului vizual. O etapă ulterioară de intervenție manuală a permis utilizatorului să modifice opțional regiunile de celule de interes pe baza acestei imagini binare pentru a separa celulele îmbinate eronat sau pentru a include celule care au fost ratate de operația de prag. Scriptul a calculat apoi zonele și perimetrele pentru fiecare ROI de celule. În plus, s-a calculat un indice de spikiness pentru fiecare celulă pe baza raportului dintre perimetrul celulei și perimetrul corpului convex corespunzător și s-a calculat o valoare pentru raportul de aspect al celulei ca raport dintre axele majore și minore ale unei elipse montate pe ROI-ul celulei.
analiza membranei blebbing: parcele referitoare la membrana blebbing au fost generate într-un mod semi-automatizat folosind un script ImageJ personalizat-scris. Pentru fiecare membrană imaginată, raportul dintre lungimea conturului unei margini a membranei și distanța euclidiană dintre punctele finale ale marginii a fost calculat la fiecare punct de timp. Din seriile de timp rezultate, densitățile spectrale de putere au fost calculate prin metoda lui Welch51. Densitatea spectrală de putere a fost apoi mediată pe o fereastră de interes, definită empiric ca timpul caracteristic în care s–au format bleb-uri (0,04-0,06 Hz); aceste valori medii au fost comparate între condițiile experimentale (Supraexpresie Marksl1b) și condițiile de control.
analiza dinamicii actinei și miozinei II în blebs: Parcele referitoare la dinamica actinei sau miozinei în celulele blebbing au fost generate într-un mod semi-automatizat folosind un script ImageJ scris personalizat. Multichannel time-lapse z-stivele au fost proiectate mai întâi maxim de-a lungul dimensiunii Z. Apoi, software-ul a identificat automat marginea unui bleb între două puncte de ancorare definite de utilizator în toate punctele de timp folosind metoda de prag Otsu încorporată ImageJ care rulează pe canalul Marksl1b-EGFP ca surogat pentru etichetarea membranei. În urma unui pas de control al calității utilizatorului pentru a asigura identificarea exactă a marginii bleb, profilul intensității canalului de actină/miozină de-a lungul marginii a fost extras la fiecare punct de timp și reprezentat în timp într-un kymograph. La fiecare punct de timp, statisticile de intensitate au fost extrase împreună cu zona bleb, definită aici ca zona proiectată în z închisă de margine și linia care unește punctele de pe ambele părți ale blebului cel mai îndepărtat de vârful bleb de-a lungul unei axe perpendiculare pe linia care unește punctele de ancorare definite de utilizator, iar intensitatea medie a canalului de actină/miozină și zona bleb au fost reprezentate în timp.
cuantificarea densității actinei corticale și a lățimii fasciculului: Imaginile de înaltă rezoluție ale actinei din HUVECs au fost achiziționate folosind un obiectiv Plan-APOCHROMAT 63x montat pe un microscop confocal Zeiss Lsm880 echipat cu un detector Airyscan și GaAsP. Aproximativ 3 regiuni pătrate de la fiecare observație au fost selectate aleatoriu și decupate de obicei 8 secțiuni optice care acoperă rețeaua corticală din acele regiuni. Imaginile proiectate de-a lungul axei Z a stivelor decupate au fost generate prin proiecție de intensitate maximă și supuse următoarei proceduri. Deoarece filamentele de actină din imagine erau ambigue și era imposibil de evaluat întreaga rețea, am cuantificat numărul de filamente de actină din regiunile limitate ca densitate a rețelei de actină. Acest lucru a fost realizat prin setarea liniilor de scanare de – a lungul axelor X și Y la fiecare 4 pixeli, iar valorile pixelilor de – a lungul fiecărei linii de scanare au fost supuse filtrului Savitzky-Golay52 pentru a calcula derivatele de ordinul întâi. Filamentele de actină au fost apoi identificate prin găsirea punctelor de trecere zero, care sunt vârfurile de intensitate ale liniei de scanare. Numărările pentru vârfuri au fost împărțite la numărul de pixeli al liniei de scanare (lățimea sau înălțimea imaginii), iar densitatea filamentelor peste imagine a fost calculată luând media acestor valori.
pentru a cuantifica lățimea pachetului de actină, liniile centrice ale pachetelor de actină au fost generate prin găsirea punctelor de trecere zero ale derivatelor de ordinul întâi calculate de filtrul Savitzky-Golay și urmate de aplicarea algoritmului de subțiere Hilditch. Pentru a elimina posibilitatea ca punctele de ramificare sau de trecere a filamentelor de actină să afecteze măsurătorile, punctele de ramificare găsite în linia scheletizată au fost eliminate și segmentate. Axa ortogonală față de segmentul general a fost determinată prin obținerea vectorului propriu, iar intensitățile fluorescente au fost eșantionate de-a lungul axei ortogonale care rulează Centrul de greutate al segmentului cu metoda de interpolare Lanczos-5. Apoi, diametrul unui filament a fost determinat de lățimea regiunii care a arătat mai mare sau egală cu jumătate din intensitatea vârfului din linia eșantionată de-a lungul axei ortogonale până la segmentul general.
statistici: analiza statistică a fost realizată folosind Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Dimensiunile eșantioanelor nu au fost predeterminate, experimentele nu au fost randomizate, iar anchetatorii nu au fost orbiți de alocare în timpul experimentelor și evaluării rezultatelor.
rezumat de raportare
informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare privind cercetarea naturii legat de acest articol.
