Ștergerea KDM6A, o Histonă Demetilază care interacționează cu MLL2,la trei pacienți cu sindrom Kabuki | Jumbuck

textul principal

sindromul Kabuki (KS; MIM 147920) a fost descrisă pentru prima dată în 1981 de Niikawa și Kuroki,1, 2 și mai mult de 400 de cazuri au fost raportate în literatură. Principalele caracteristici clinice sunt trăsăturile faciale distinctive, întârzierea dezvoltării, dizabilitatea intelectuală ușoară până la moderată, întârzierea creșterii post-natale și caracteristici suplimentare, inclusiv anomalii scheletice, hipodontie și tampoane persistente ale degetului fetal. Analiza comparativă a microarray-ului de hibridizare genomică (CGH) nu a reușit să detecteze o anomalie recurentă la 72 de indivizi KS.3-8 utilizarea strategiei de secvențiere a exomilor a condus recent la identificarea mutațiilor MLL2 (MIM 602113) ca o cauză majoră a KS.9 în cinci serii publicate recent, mutațiile în MLL2 au fost găsite la 56% -76% dintre pacienții cu KS.9-13

deoarece o proporție semnificativă de pacienți nu au o mutație MLL2 detectabilă, am postulat existența unor gene suplimentare asociate cu KS. În căutarea unei alte mutații genetice cauzatoare de KS, zece gene care interacționează cu MLL2 au fost examinate la 15 indivizi KS negativi cu mutație MLL2 și nu au fost identificate mutații patogene.11 o altă genă care codifică o proteină care interacționează MLL2, KDM6A (cunoscută anterior ca UTX; MIM 300128), a fost testată la 22 de indivizi KS negativi cu mutație MLL2 și, din nou, nu au fost detectate mutații cauzale.13

prin utilizarea analizei CGH matrice (platforma Agilent 244k), am identificat microdeleții de novo Xp11.3 la două fete KS belgiene MLL2-mutație negativă (pacienții 1 și 2). Deoarece ambele ștergeri au fost de novo, sunt probabil patogene. Ambele ștergeri au inclus fie o parte din, fie toate KDM6A. mai mult, nu au existat ștergeri de KDM6A într-un cohortă de 411 controale normale într-un studiu anterior.14 deleția la pacientul 1 a inclus exonii KDM6A 21-29, care codifică partea terminală a domeniului catalitic al KDM6A și CXorf36, o genă implicată recent în autismul legat de X.15 la pacientul 2, KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) și FUNDC1 (Figura 1) au fost eliminate complet. Funcțiile DUSP21 și FUNDC1 rămân necunoscute.

Regiunea Xp11.3 afișarea ștergerilor pacienților

Regiunea Xp11.3 prezintă ștergerile extrase din browserul genomului UCSC (GRCh37/hg19) pentru pacienții 1, 2 și 3. Piesele negre complete reprezintă ștergerea fiecărui pacient, iar numărul fiecărui pacient este deasupra pistei respective. Ștergerea la pacientul 1 se întinde pe 283,5 kb de la baza 44.941.324 la baza 45.224.829, ștergerea pacientului 2 se întinde pe 815.7 kb de la baza 44.377.858 la baza 45.193.629, iar ștergerea pacientului 3 se întinde pe 45,4 kb de la baza 44.866.302 la baza 44.912.718. Genele din zonă sunt notate sub piesele de ștergere. Cnv – urile din Baza de date a variantelor genomice sunt prezentate pe liniile de jos. Nu există rapoarte anterioare privind modificările numărului de copii KDM6A.

apoi am secvențiat KDM6A prin secvențierea Sanger și am căutat ștergeri sau duplicări intragenice cu o matrice agilentă personalizată vizată CGH într-o cohortă de 22 MLL2-mutație negativă KS indivizi (8 femele, 14 bărbați). În conformitate cu standardele etice ale Comitetului de etică al Institutului de patologie et de G, S-a obținut consimțământul părinților pentru analiza ADN a tuturor participanților la acest studiu și pentru publicarea fotografiilor. Datele microarray CGH (date suplimentare, disponibile online) discutate în această publicație au fost depuse în Centrul Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) expresia genelor Omnibus (GEO)16 și sunt accesibile în cadrul gse32567 de aderare (a se vedea secțiunea Numere de aderare).

nu au fost detectate mutații punctuale, dar am identificat o deleție intragenică de novo (exonii 5-9) la un individ italian, masculin KS (pacientul 3). De asemenea, am secvențiat UTY (MIM 400009), paralogul cromozomului Y al KDM6A (vezi mai jos) și am căutat ștergeri sau duplicări intragenice așa cum s-a menționat mai sus, dar nu am detectat nicio mutație.

pacienții 1 și 3 au prezentat un fenotip tipic KS, incluzând fisuri palpebrale lungi, eversiune laterală a pleoapei inferioare și dizabilități intelectuale moderate până la severe (Tabelul 1 și Figura 2). Deși trăsăturile faciale ale pacientei 2 nu erau la fel de clasice, ea a prezentat multe caracteristici ale acestei tulburări, inclusiv raritatea laterală a sprâncenelor, genele lungi, strabismul, fisurile palpebrale lungi, urechile mari și proeminente, tampoanele persistente ale degetului fetal, coarctația aortică, plinătatea areolară în copilărie și hirsutismul. Ea a prezentat o întârziere ușoară de dezvoltare și a avut un scor normal al coeficientului de inteligență verbală (IQ), un scor IQ slab de performanță și un comportament hiperactiv (Tabelul 1 și Figura 2). Am observat că pacienții 1 și 2 au avut halucinații lungi (Figura 3).

aspectul Facial la persoanele afectate

(a) pacient 1.

(B) Pacient 2.

(C) Pacient 3.

observați fisurile palpebrale lungi la pacienții 1 și 2 și sprâncenele arcuite la pacienții 1 (ușoare) și 3.

apariția picioarelor la persoanele afectate

(a) pacient 1.

(B) Pacient 2.

observați halucinațiile lungi la ambii pacienți.

astfel, eliminările KDM6A la acești trei pacienți sunt asociate cu un spectru fenotipic larg, variind de la indivizi tipici KS (pacienții 1 și 3) până la o prezentare clinică mai ușoară (pacientul 2). Această variabilitate clinică este, de asemenea, o caracteristică a pacienților cu mutații MLL2.13 Cu toate acestea, ar trebui luate în considerare și posibilele efecte ale deleției CXorf36 la pacientul 1 și ale deleției CXorf36, DUSP21 și FUNDC1 la pacientul 2 asupra fenotipurilor respective.

KDM6A (29 exoni) este una dintre genele cromozomiale X care scapă în mare măsură de inactivarea X.17 codifică o proteină reziduală 1,401 care conține două domenii funcționale. Domeniul catalitic este o histonă demetilază care catalizează în mod specific demetilarea lizinei 27 mono-, di-și trimetilat pe histona H3 (H3K27).18,19 această demetilare mediază expresia specifică țesutului diferitelor gene și este implicată în cea mai mare parte în procesele de dezvoltare și în ciclul celular.19-22 interesant, KDM6A și MLL2 acționează împreună în controlul epigenetic al cromatinei active transcripțional prin contracararea proteinelor din grupul Polycomb (PcG).22 celălalt domeniu funcțional al KDM6A joacă un rol în remodelarea cromatinei prin interacțiunea cu complexul de remodelare comutator/zaharoză nefermentabil (SWI/SNF) care conține activatorul de transcriere Brg1.23

ca MLL2, KDM6A joacă un rol în embriogeneză și dezvoltare. Dutx homozigot (Drosophila kdm6a ortholog) mutanții Drosophila manifestă ochi aspri, aripi dismorfice și modificarea pieptenilor sexuali.21 acest fenotip seamănă cu fenotipul trithorax, susținând în continuare ideea că KDM6A contracarează represiunea PcG.21 în plus, UTX-1 (C. elegans kdm6a ortholog) ar putea afecta deciziile de soarta dezvoltării în celulele precursoare vulvale C. elegans prin reglarea transcripției genelor care codifică complexul proteic retinoblastom (RB), care a fost conservat de la viermi la oameni.20 Kdm6a1 este, de asemenea, important în expresia genelor HOX posterioare la peștele zebră.19 în plus, KDM6A, împreună cu MLL2, joacă un rol major în reglarea genelor specifice mușchilor în timpul embriogenezei.22,24 în cele din urmă, membrii unei alte familii importante de gene de dezvoltare (genele T-box, care acționează în mezoderm în formarea inimii și vertebrelor) recrutează KDM6A pentru a-și activa genele țintă, subliniind din nou rolul KDM6A în procesele de dezvoltare.23 interesant, majoritatea mutațiilor patogene pentru genele T-box raportate în bolile umane sunt localizate în domeniul T-box care interacționează cu KDM6A.23

KDM6A scapă de inactivarea X,17 dar s-a sugerat că la șoareci, expresia Kdm6a din cromozomul X inactiv este semnificativ mai mică decât cea din cromozomul X activ.Expresia 25 Kdm6a este mai mare în creierul adult, ficatul adult și regiunile specifice ale creierului în curs de dezvoltare la femei decât la bărbați.25 UTY este paralogul KDM6A pe cromozomul Y.17 UTY are o similitudine de secvență de aminoacizi 84% cu KDM6A și ar putea compensa expresia crescută a KDM6A la femei, în ciuda faptului că activitatea demetilazei nu a fost încă demonstrată pentru acest paralog KDM6A.14,25

nu este surprinzător să găsim o altă genă asociată cu KS pe cromozomul X, deoarece au fost raportate pacienți asemănători KS cu cromozomi X (r) cu inel mic.26-34 în plus, există o suprapunere clară între defectele cardiace congenitale predominante la pacienții cu KS de sex masculin (coarctație aortică și alte obstrucții stângi) și cele găsite la pacienții cu cromozomi monosomici X și r(X).28,35 cromozomii mici r(X) duc de obicei la sindromul Turner prin inactivarea completă a r (X). Cu toate acestea, nu este clar de ce unii indivizi dezvoltă un fenotip asemănător KS. Inactivarea incompletă a cromozomului X și expresia ulterioară a genelor de obicei reprimate au fost sugerate ca explicație pentru fenotipul KS la unii pacienți cu r(X).32-34 KDM6A a fost eliminat la cei trei pacienți care au avut atât un fenotip asemănător KS, cât și un R(X) în care au fost cartografiate punctele de întrerupere; această constatare este în concordanță cu ipoteza că ștergerea KDM6A joacă un rol important în fenotipul asemănător KS observat la unii pacienți cu un r(X).30,32,34 nu am putut demonstra haploinsuficiența pentru KDM6A la pacienții 1 și 2, deoarece expresia KDM6A a fost foarte scăzută în limfocitele din sângele periferic (datele nu au fost prezentate). Cu toate acestea,studiile au arătat că două copii ale Kdm6a sunt necesare pentru exprimarea normală la embrionii femele de șoarece și la șoarecii adulți, 25 sugerând că haploinsuficiența ar putea fi mecanismul patogen. Cu toate acestea,această explicație nu ar explica faptul că 45, X și alți pacienți r(X) cu o ștergere KDM6A nu dezvoltă toți fenotipul Kabuki.

la pacienții 1 și 2, rapoartele de inactivare moleculară X sunt puternic înclinate și sunt 89:11 și, respectiv, 97:3. Profilul de inactivare X a fost determinat prin amplificarea PCR a repetării CAG în exonul 1 al genei receptorilor androgeni înainte și după digestia ADN cu HpaII și CfoI. Pentru a determina dacă copia ștearsă a KDM6A a fost localizată pe cromozomul X activ sau inactiv, am efectuat o analiză de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) cu o sondă KDM6A pe cromozomii X care au fost etichetați diferențiat prin încorporarea 5-bromo-2′-deoxiuridinei (5-BrdU). Rezultatele au arătat că copia ștearsă a KDM6A a fost localizată pe cromozomul X inactiv în toate cele 70 de mitoze analizate la ambii pacienți (Figura 4). Faptul că KDM6A scapă de inactivarea X17 sugerează că limfocitele stimulate de fitohemaglutinină (PHA) care au o copie ștearsă a KDM6A pe cromozomul X inactiv au un avantaj de supraviețuire față de liniile celulare care au o copie ștearsă a KDM6A pe cromozomul X activ. Această sugestie este în concordanță cu ipoteza că, deși KDM6A scapă de inactivarea X, expresia sa este mai mică de cromozomul X inactiv decât de cromozomul X activ.25

Image of fish Study on X cromozomi diferențiat etichetate cu 5-BrdU

o imagine a unui studiu de pește arată cromozomi X diferențiat etichetate prin încorporarea 5-BrdU. Cromozomul X inactiv (în cercul alb) apare mai luminos decât cromozomul X activ. Sondele subtelomerice xqter hibridizează la ambii cromozomi X (săgeți albastre). Semnalul KDM6A (săgeata albă) este absent din cromozomul X inactiv și este prezent pe cromozomul X activ. Pentru acest experiment, limfocitele din sângele periferic de la pacienții 1 și 2 au fost stimulate cu fitohemaglutinină și au fost cultivate timp de 72 de ore. pentru a identifica cromozomul X inactiv cu replicare târzie, am tratat celulele cu 5-brdu (30 hectogg/ml) 5 ore înainte de recoltare. Colcemid a fost apoi adăugat la o concentrație de 0,2 oztg/ml, iar 1 oră mai târziu, preparatele de metafază au fost produse prin proceduri standard care implică umflarea în 75 mM KCl și fixarea în 3:1 metanol/acid acetic. Am efectuat analiza peștilor utilizând simultan o sondă subtelomerică xqter etichetată cu SpectrumOrange (Visis) pentru a indica cromozomii X (săgeata albastră) și RP11-435k1 etichetați cu SpectrumOrange (AmpliTech) pentru a distinge între cromozomii X șterși și nedeletați (săgeata albă). Pentru a facilita detectarea 5-BrdU încorporat, am denaturat ADN-ul celular în 2n HCl timp de 30 min la 37 C. 5-brdu a fost apoi etichetat cu un anticorp monoclonal specific 5-BrdU conjugat cu fluoresceină (Roche) (1 hectar/ml). În cele din urmă, am contracarat ADN-ul prin aplicarea unei soluții antifade care conține 0.1 hectolitru/ml DAPI.

rolul UTY este în mare parte necunoscut și nu are activitate demetilază in vitro. Constatarea unui individ KS masculin (pacientul 3) cu o deleție intragenică a KDM6A și cu severitate clinică similară cu cea a pacientului 1 sugerează că UTY ar putea compensa parțial pierderea KDM6A la indivizii de sex masculin, așa cum s-a sugerat anterior în literatura de specialitate.25

în ceea ce privește MLL2, mutațiile somatice homozigote și hemizigote în KDM6A au fost identificate în diferite tipuri de cancer (mielom multiplu, carcinom cu celule scuamoase esofagiene, carcinom cu celule renale, leucemie mieloidă, cancer de sân, cancer colorectal și glioblastom), sugerând că KDM6A este o genă care suprimă tumorile.14 cu toate acestea, cancerul nu este o caracteristică cheie A SK, având în vedere că această complicație a fost raportată la doar șapte pacienți cu SK36,37 (leucemia limfoblastică acută, limfomul Burkitt, sarcomul fibromixoid, sarcomul sinovial și hepatoblastomul au fost raportate o singură dată, iar neuroblastomul a fost raportat la două persoane cu SK).35,36 dacă pierderea ambelor alele este suficientă pentru a provoca cancer, s-ar aștepta ca cancerul să apară mai frecvent în KS, cum ar fi în retinoblastom (mim 180200) sau tumora Wilms (MIM 194070). Acest lucru sugerează fie că pierderea celei de-a doua alele în MLL2, KDM6A sau UTY este necesară, dar nu suficientă pentru dezvoltarea cancerului, fie că această complicație este subrecunoscută, demonstrând importanța studiilor de Istorie Naturală în sindroamele rare.37

următoarele histone metilaze și histone demetilaze au fost implicate în alte sindroame cu anomalii multiple: Ehmt1 (mim 607001; sindromul Kleefstra ), SETBP1 (mim 611060; sindromul Schinzel-Giedion ), JARID1C (mim 314690; Claes-Jensen-type, sindromul de retard mental legat de X), PHF8 (MIM 300560; Siderius-tip, sindromul retardului mental legat de X) și MLL2 în KS. Identificarea mutațiilor patogene KDM6A la pacienții cu KS extinde rolul factorilor de modificare a histonei în dizabilitatea intelectuală și malformația congenitală.

în concluzie, raportăm mutațiile KDM6A ca o cauză a KS la un mascul și două femele. Descoperirile noastre confirmă atât eterogenitatea genetică KS, cât și un locus pe cromozomul X, așa cum s-a sugerat anterior. Deoarece unii pacienți cu SK au fost negativi pentru secvențierea MLL2, KDM6A și CUY și nu au prezentat ștergeri sau duplicări în timpul screeningului, este probabil ca alte gene asociate cu SK să rămână descoperite.