purificarea și caracterizarea asparaginazei din semințele de Phaseolus vulgaris

rezumat

L-asparaginaza din bacterii a fost utilizată în tratamentul leucemiei limfoblastice acute. Scopul acestui studiu a fost purificarea și caracterizarea l-asparaginazei din semințele de Phaseolus vulgaris în loc de surse microbiene. L-asparaginaza a fost purificată până la omogenitate aparentă. Enzima are o masă moleculară de 79 kDa. Asparaginaza purificată a avut o activitate foarte scăzută față de un număr de analogi de asparagină și glutamină. L-asparaginaza a fost liberă de activitatea glutaminazei. Parametrii cinetici, Km și Vmax ai enzimei purificate, s-au dovedit a fi de 6,72 mM și, respectiv, 0,16 MMCT. Enzima a avut un pH optim la 8,0. Enzima a prezentat o stabilitate ridicată la pH alcalin (pH 7,5–9,0) atunci când a fost incubată timp de până la 24 h. l-asparaginaza a avut aceeași temperatură optimă și stabilitate termică la 37 C. k+ a reușit să sporească foarte mult activitatea asparaginazei cu 150% în comparație cu alte metale testate. În concluzie, l-asparaginaza nu a prezentat activitate glutaminază și stabilitate bună într-o gamă largă de condiții fiziologice și, prin urmare, ar putea fi utilizată ca potențial candidat pentru tratamentul leucemiei limfoblastice acute.

1. Introducere

l-asparaginaza (l-asparagina amidohidrolaza E. C. 3.5.1.1) este utilizată în tratamentul leucemiei limfoblastice acute și a limfomului non-Hodgkin . Utilizarea L-asparaginazei în terapia anticanceroasă se bazează pe capacitatea sa de a scinda l-asparagina, un aminoacid esențial pentru creșterea limfoblastelor, la amoniac și acid L-aspartic în ser și lichidul cefalorahidian, deoarece limfoblastele nu sunt capabile să producă l-asparagină endogenă, ceea ce duce la moartea acestor celule . Majoritatea celulelor canceroase sunt dependente de o sursă exogenă a acestui aminoacid pentru supraviețuire. Cu toate acestea, celulele normale sunt capabile să sintetizeze l-asparagina și astfel sunt mai puțin afectate de epuizarea rapidă a acesteia datorită tratamentului cu această enzimă. L-asparaginaza poate fi, de asemenea, utilizată pentru a reduce formarea acrilamidei în alimentele prăjite și gătite la cuptor, în special în chipsurile de cartofi . Formarea acrilamidei a fost atribuită reacției asparaginei libere și zaharurilor reducătoare . Depleția asparaginei de către asparaginază a împiedicat formarea acrilamidei .

l-asparaginaza este distribuită pe scară largă între plante, animale și microorganisme . În plante, această enzimă a fost detectată pentru prima dată în semințele în curs de dezvoltare ale Lupinus albus . Asparaginaza a fost, de asemenea, purificată din testa semințelor de maturare de L. polyphyllus . Au fost identificate două forme ale enzimei. O formă independentă de K + se găsește în L. arboreus și L. polyphyllus și o formă dependentă de K + se găsește în Pisum sativum și alte câteva specii de leguminoase, inclusiv alte specii Lupinus . Lucrul cu anticorpi la forma independentă de K + de la L. polyphyllus nu a evidențiat nicio reacție încrucișată nici cu asparaginaza de mazăre, nici cu un număr de soiuri de Lupin care conțin enzima dependentă de K+, sugerând că cele două forme de asparaginază sunt imunologic distincte .

s-au raportat foarte puține informații despre utilizarea asparaginazei vegetale în tratamentul leucemiei limfoblastice acute . Prin urmare, scopul principal al acestui studiu a fost purificarea și caracterizarea l-asparaginazei din semințele de Phaseolus vulgaris Fără l-glutaminază în loc de l-asparaginază din surse microbiene, care este utilizată ca anticancer și a provocat efecte secundare datorită răspunsurilor sale imunologice.

2. Material și metode

2.1. Materiale vegetale

semințe Mature din Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 au fost obținute de la Centrul de Cercetare Agricolă, Cairo, Egipt.

2.2. Purificarea asparaginazei

2.2.1. Extract brut

extractul brut de asparaginază a fost preparat prin omogenizarea a 50 g semințe din Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 în tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 care conține 10% glicerol, 50 mm KCl, 12,5 mm-mercaptoetanol și 1 mm PMSF. Omogenatul a fost centrifugat la 10.000 de grame, iar supernatantul a fost desemnat ca extract brut. Extractul brut a fost concentrat prin dializă împotriva zaharozei solide.

2.2.2. Coloana Deae-Sepharose

extract brut concentrat a fost aplicat pe o coloană Deae-Sepharose (15 1,6 cm I.d.) care a fost anterior echilibrată cu tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0. Enzima a fost eluată prin diferite concentrații de KCl preparate în același tampon la un debit de 60 mL/h și au fost colectate fracții de 3 mL. Trei vârfuri de proteine au fost eluate cu activitatea asparaginazei conform ordinii de eluție (asparaginazele I, II și III).

2.2.3. Sephacryl S-200

asparaginaza i cu cea mai mare activitate a fost aplicată pe o coloană Sephacryl s-200 (90 0.6 cm i.d.) care a fost anterior echilibrat cu același tampon la un debit de 30 mL/h și au fost colectate fracții de 3 mL.

2.3. Testul asparaginazei

activitatea L-asparaginazei a fost măsurată prin metoda modificată a Wriston . L-asparaginaza catalizează l-asparagina la acidul L-aspartic și amoniacul, iar acesta din urmă reacționează cu reactivul Nessler pentru a produce un produs de culoare portocalie. Amestecul de analiză enzimatică a constat din 900 ilqql de l-asparagină proaspăt preparată (20 mM) în tampon Tris-HCl de 50 mM (pH 8,0), 50 mm KCl și 100 ilqql de extract brut al enzimei. Amestecul de reacție s-a incubat la 37 CTC timp de 30 min, iar reacția s-a oprit prin adăugarea a 100 eqql de acid tricloroacetic 15%. Amestecul de reacție a fost centrifugat la 10.000 de grame pentru 5 min la 4 de grame pentru a îndepărta precipitatele. Amoniacul eliberat în supernatant a fost determinat folosind tehnica colorimetrică prin adăugarea unui reactiv Nessler de 100 unktil în proba care conține 100 unktil supernatant și 800 unktil apă distilată. Conținutul eșantionului a fost vortexat și incubat la temperatura camerei timp de 10 minute, iar OD a fost măsurată la 425 nm. Amoniacul produs în reacție a fost determinat pe baza curbei standard obținute cu sulfat de amoniu. O unitate de activitate a l-asparaginazei este definită ca fiind cantitatea de enzimă care eliberează 1 centimol de amoniac pe minut la 37 centimol C.

2.4. Determinarea proteinei

proteina a fost cuantificată prin metoda Bradford cu albumină serică bovină ca standard.

2.5. Determinarea greutății moleculare

greutatea moleculară nativă a fost determinată de Sephacryl s-200. Coloana a fost calibrată cu citocrom C (12.400), anhidrază carbonică (29.000), albumină serică bovină (67.000), alcool dehidrogenază (150.000) și amilază-amilază (200.000). Albastru de Dextran (2.000.000) a fost utilizat pentru a determina volumul gol (Vo). Greutatea moleculară a subunității a fost estimată prin electroforeza în gel SDS-poliacrilamidă . Pentru curba de calibrare au fost utilizate fosforilaza B denaturată SDS (94.000), albumina serică bovină (67.000), ovalbumina (43.000), anhidraza carbonică (30.000), inhibitorul tripsinei de soia (20.000) și lactalbumina-lactalbumină (14.200).

2.6. Caracterizarea asparaginazei

2.6.1. Specificitatea substratului

activitatea asparaginazei a fost determinată cu unii analogi ai l-asparaginei. Activitatea relativă a fost exprimată ca raportul procentual al activității enzimei determinat împotriva diferiților analogi de structură ai l-asparaginei față de activitatea enzimatică cu L-asparagină.

2.6.2. Parametrii cinetici

valorile constantelor Michaelis (Km) și viteza maximă (Vmax) au fost determinate folosind l-asparagina ca substrat în intervalul 2-20 mM. parametrii cinetici au fost determinați din graficul Lineweaver-Burk.

2.6.3. Efectul pH-ului

pH-ul optim pentru activitatea asparaginazei a fost determinat prin testarea activității la diferite valori ale pH-ului. Stabilitatea pH–ului a fost testată prin incubarea enzimei la un pH de 5,0-9,0 timp de 24 h la 4 CTC în absența substratului și activitatea reziduală a fost determinată în condițiile standard de testare.

2.6.4. Efectul temperaturii

temperatura optimă pentru activitatea asparaginazei a fost determinată prin testarea enzimei la temperaturi diferite. Stabilitatea termică a fost măsurată prin incubarea enzimei singure la temperaturi diferite timp de 1 oră. după tratamentul termic, soluția enzimatică a fost răcită și activitatea reziduală a fost testată după adăugarea substraturilor.

2.6.5. Efectul ionilor metalici

efectele diferiților ioni metalici asupra activității enzimei au fost determinate prin preincubarea enzimei singure cu ioni metalici de 10 mM timp de 15 minute înainte de adăugarea substratului. Activitatea care a fost testată în absența ionilor metalici a fost luată ca 100%.

3. Rezultate și discuții

rezultatele etapelor de purificare a asparaginazei din P. vulgaris sunt rezumate în tabelul 1. Profilul de eluție al cromatografiei pe coloana DEAE-Sefaroză (Figura 1) a arătat trei vârfuri de proteine cu activitate asparaginază. Vârful unu cu cea mai mare activitate a asparaginazei a fost aplicat pe o coloană Sephacryl S-200 (Figura 2). L-asparaginaza I a fost purificată de 21,7 ori cu o activitate specifică de 846 unități/mg proteină. Asparaginaza I s-a dovedit a fi pură după coloana Sephacryl S-200, evaluată prin SDS-PAGE (Figura 3). Greutatea moleculară a asparaginazei I prin procedurile Sephacryl S-200 și SDS-PAGE a dat o valoare de 79 kDa ca subunitate monomeră. Această constatare este în acord cu greutățile moleculare pentru asparaginaze din Vigna unguiculata (70 kDa) și Lupinus polyphyllus (75 kDa) . O greutate moleculară medie de 58 kDa a fost detectată pentru asparaginază din frunzele de mazăre . Pentru asparaginazele bacteriene, greutatea moleculară a variat de la 140 la 160 kDa cu subunități tetramerice . O greutate moleculară foarte mică de 11,2 kDa a fost detectată pentru Streptobacillus sp. Kk2s4 asparaginază .

Figura 1

un profil tipic de eluție pentru cromatografia asparaginazei de la P. vulgaris pe coloana Deae-Sepharose (15 int. 1,6 cm i. d.) echilibrat anterior cu tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 la un debit de 60 mL/h și fracții de 3 mL.

Figura 2

filtrarea în Gel a asparaginazei I din fracția Deae-Sepharoză pe coloana Sephacryl S-200 (90 de la 1,6 cm i.d.). Coloana a fost echilibrată cu tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 la un debit de 30 mL/h și fracții de 3 mL.

Figura 3

SDS-pagină pentru omogenitatea și determinarea greutății moleculare a asparaginazei I din Phaseolus vulgaris. (1) markeri proteici; (2) Sephacril S-200 asparaginaza I.

specificitatea substratului asparaginazei I a fost examinată utilizând un număr de analogi de asparagină și glutamină (Tabelul 2). Activitatea cu L-asparagina a fost considerată 100% activitate. DL-asparagina a prezentat 30% din activitatea enzimei, unde DL-asparagina este compusă dintr-un 1 : 1 amestec racemic. Analogii D-asparaginei, acidului L-aspartic și acidului L-glutamic au avut o activitate foarte scăzută față de asparaginaza I. nu a fost detectată nicio activitate în prezența L-glutaminei. Prin urmare, asparaginaza I din P. vulgaris este liberă de glutaminază. Contaminarea asparaginazei cu activitatea glutaminazei a provocat efecte secundare în cursul terapiei anticanceroase . Asparaginaza L. arboreus a hidrolizat numai l-asparagina și hidroxamatul de DL-aspartil . V. unguiculata asparaginaza a fost specifică pentru l-asparagină, nu a hidrolizat d-asparagina și nu a fost specifică pentru L-glutamină .

parametrii cinetici, Km și Vmax ai enzimei purificate, s-au dovedit a fi de 6,72 mm asparagină și, respectiv, 0,16 mmm amoniac/mL (Figura 4). Valori Km similare de 6,6 și 7,0 mM au fost determinate pentru asparaginazele de la L. arboreus și, respectiv, L. angustifolius . Asparaginaza din semințele de Lupinus are Km înalți pentru asparagină (12,2 mM) . Km Scăzut (1.2 mM) a fost determinată pentru asparaginază de la V. unguiculata . Pentru bacterii, valorile Km Pentru l-asparaginaza din Escherichia coli și Erwinia carotovora au fost de 3, 5 și, respectiv, 7, 14 mM .

Figura 4

Lineweaver-Burk complot privind asparaginaza I de la viteze P. vulgaris la diferite concentrații de l-asparagină.

asparaginaza i a prezentat pH optim la 8,0 (Figura 5). Între pH 6,0 și 9,0, mai mult de 50% din activitatea sa a fost păstrată. Deși activitatea maximă la pH fiziologic este una dintre condițiile prealabile ale L-asparaginazei pentru activitatea antitumorală, enzima purificată ar fi utilă deoarece 80% din activitatea enzimei a fost reținută la pH 7,5. Enzima a prezentat stabilitate la pH alcalin (pH 7,5–9,0), deoarece și-a păstrat 90% din activitatea inițială atunci când a fost incubată până la 24 de ore (Figura 6). Cu toate acestea, pH-ul optim al l-asparaginazelor din mai multe plante a variat de la 8,0 la 8,5 . Majoritatea l-asparaginazelor din bacterii au prezentat pH-ul alcalin optim (8,0-10).

Figura 5

pH optim al asparaginazei I din P. vulgaris. Activitatea enzimei a fost măsurată la diferite pH-uri folosind metoda de testare standard, așa cum s-a descris anterior.

Figura 6

stabilitatea pH-ului asparaginazei I de la P. vulgaris la pH diferit după incubare timp de 24 ore la 4 C.

s-a constatat că asparaginaza I are o temperatură optimă la 37 ct (figura 7). A fost raportată temperatura optimă similară a asparaginazei de la V. unguiculata (40 C). Această temperatură a fost, de asemenea, similară cu cea raportată pentru Pseudomonas aeruginosa și Pectobacterium carotovorum . Activitatea optimă a Streptobacillus sp. asparaginaza a fost înregistrată la 35 C . Dimpotrivă, L-asparaginaza din Chrombacteriaceae și Proteus vulgaris a fost observată la 20 C C și, respectiv, 57 C C . A fost detectată o relație neliniară între asparaginaza I și stabilitatea temperaturii (figura 8). Activitatea enzimei a fost stabilă până la 37 de centicenți C după incubare timp de 1 oră. asparaginază din V. unguiculata a fost stabilă până la 40 de centicoli C după incubare timp de 15 minute . Asparaginazele de la P. carotovorum și C. annuum și-au păstrat activitatea inițială după incubare la 40 CTC și 45 CTC timp de 60 min .

Figura 7

temperatura optimă a asparaginazei I de la P. vulgaris. Activitatea enzimei a fost măsurată la diferite temperaturi folosind metoda de testare standard, așa cum s-a descris anterior.

figura 8

stabilitatea termică a asparaginazei I de la P. vulgaris. Amestecul de reacție a fost preincubat la diferite temperaturi timp de 60 min înainte de adăugarea substratului, urmată de răcirea într-o baie de gheață. Activitatea enzimatică a fost măsurată utilizând metoda de testare standard, așa cum s-a descris anterior. Activitatea la ora zero a fost luată ca activitate 100%.

efectul diferiților ioni metalici asupra asparaginazei I a fost examinat (Tabelul 3). Ionii metalici au fost utilizați la concentrația de 10 mM. K+ a reușit să sporească considerabil activitatea asparaginazei I cu 150%. La plante, au fost identificate asparaginaze independente de K+și dependente de K+. K + a acționat, de asemenea, ca potențator pe P. carotovorum asparaginază . Ca2 + a îmbunătățit ușor activitatea cu 110%, dar Cu2+ a inhibat ușor activitatea asparaginazei I. În plus, Pb2+ și Hg2+ au provocat un efect parțial inhibitor asupra asparaginazei I. Cu toate acestea, V. unguiculata asparaginaza a fost activată de Ni2+ și Co2+ și a fost inhibată de Mn2+, Zn2+, Ba2+ și Hg2+ . EDTA ca agent chelator metalic a determinat un efect parțial inhibitor asupra asparaginazei I. Cu toate acestea, EDTA nu a avut niciun efect asupra P. carotovorum asparaginazei .

4. Concluzii

l-asparaginaza I din P. vulgaris a fost purificată în formă fără glutaminază, ceea ce poate reduce posibilitatea reacțiilor adverse în cursul terapiei anticanceroase. Enzima a arătat o bună stabilitate într-o gamă largă de condiții fiziologice ca pH și temperatură. În următoarea etapă a proiectului nostru, l-asparaginaza I de la P. vulgaris va fi utilizată ca potențial candidat pentru tratamentul leucemiei limfoblastice acute.

Conflict de interese

autorii nu au niciun conflict de interese relevant pentru această lucrare de dezvăluit.

mulțumiri

acest proiect a fost finanțat de Planul Național pentru știință, tehnologie și inovare (MAARIFAH), orașul King Abdulaziz pentru știință și Tehnologie, Arabia Saudită, premiul nr. (11-BIO-1516-03). Autorii recunosc, de asemenea, cu mulțumiri știință și tehnologie unitate, Universitatea King Abdulaziz, pentru suport tehnic.