testul kinazei
preparat de Swathi Arur
Protein kinaza (soluții stoc de 1-10 mg/ml kinaze pure) – pentru aceste teste, folosesc kinaza erk2 purificată (NEB). Pentru fiecare enzimă, este important să se determine tamponul optim, puterea Ionică și pH-ul pentru activitate. Dacă aceste condiții nu au fost stabilite, protocolul enumerat mai jos poate fi utilizat ca punct de plecare.
substrat (soluție stoc de 10 mM) – substraturile conțin de obicei o serină /treonină într-un motiv al locului de fosforilare. Ca control folosesc proteina bazică de mielină (obținută din Sigma), care a fost utilizată de NEB pentru a calibera kinaza ERK2.
în plus, substraturile trebuie să aibă o sarcină pozitivă netă pentru a facilita legarea la filtrele de fosfoceluloză utilizate în test. Pentru legarea cantitativă la hârtia de fosfoceluloză, se recomandă să existe cel puțin 2 reziduuri de bază și un amino terminal liber. Dacă nu se cunoaște un motiv al locului de fosforilare, se poate utiliza un substrat general de tirozin kinază. De exemplu,” proteina de bază a mielinei ” (este un substrat nespecific pentru multe MAPKs). Pentru reacțiile inițiale, trebuie utilizată o concentrație de substrat de 0,7-1,5 mM. Pentru a determina parametrii cinetici pentru fosforilarea peptidei sintetice, este necesară o gamă de concentrații de peptide
10x tampon kinază – conține 5 mg/mL BSA (pentru a preveni adsorbția kinazei în tubul de testare), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP/MgCl2 (achiziționat de la Upstate Biotech – cocktail de magneziu/ATP # 20-113) – o soluție stoc de 1-5 mM este convenabilă. Rețineți că majoritatea MAPK-urilor au valori Km pentru ATP în intervalul 10-150 uM, deci pentru experimentele cinetice este important să se utilizeze concentrații saturate de ATP pentru a ajunge la valori de Km și Vmax pentru peptide.
ATP – 10 MCI/mL.
teste de kinază ERK2
a) test de autoradiografie:
- se efectuează un test standard de kinază într-un volum de 25 ul:
- 2,5 ul de tampon de 10x kinază
- 5 ul de 1,0 mM MgCl2 /ATP (concentrație finală de 0,2 mM)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul de substrat de 10 mM (1.Concentrație finală de 2 mM)
- 1 U a kinazei ERK2
- H2O până la 25 ul
1. Înainte de experimente, pregătiți un cocktail care conține suficient tampon, ATP și ATP pentru a finaliza testele. Pentru teste la diferite concentrații de substrat, substratul trebuie diluat și adăugat separat la fiecare tub. După distribuirea cocktailului în tuburi microcentrifuge de 1,5 ml, așezați tuburile într-o baie de apă la 30 de grade C timp de 30 de minute. Reacțiile trebuie inițiate prin adăugarea de kinază și lăsate să se desfășoare la 30 de grade C.
2. După timpul dorit, terminați reacțiile adăugând 2 x tampon de probă SDS și ieșiți pe un gel.
3. Uscați gelul pe o hârtie Whatman 3.0 și expuneți gelul uscat la o autoradiogramă și păstrați caseta la-70C timp de 2 ore. (pentru expuneri mai lungi, asigurați-vă că filmul este din nou uscat înainte de a pune o nouă autoradiogramă pe el).
b) analiza cinetică:
1. Efectuați testul kinazei ca mai sus, de data aceasta utilizați diferite concentrații ale substraturilor începând de la 50nm la 1mm. Opriți reacția după 30 de minute adăugând 45 ul acid tricloroacetic rece la gheață 10% (TCA) la fiecare reacție. Vortex reacțiile.
3. Rotiți timp de 2 minute în microcentrifuge (10K rpm).
4. Punctați 35 ul supernatanților pe cercuri de filtrare cu fosfat de celuloză Whatman P81 cu diametrul de 2,1 cm.
6. Spălați cercurile filtrului P81 de trei ori cu 500 ml acid fosforic rece 0,5% (5-10 minute pe spălare). Progresul etapelor de spălare poate fi urmat de îndepărtarea cercului filtrului P81 pentru o reacție goală și verificarea acestuia cu un contor Geiger.
7. Se spală o dată cu 200 ml acetonă la temperatura camerei timp de 5 minute.
8. Lăsați cercurile filtrului să se usuce la temperatura camerei.
9. Puneți cercurile de filtrare în flacoane de scintilație și măsurați încorporarea 32P numărând tampoanele uscate într-un contor de scintilație. Activitatea specifică a ATP într-o reacție kinază (de exemplu, în cpm/pmol) poate fi determinată prin depistarea unei probe mici (2-5 ul) a reacției pe un cerc filtrant P81 și numărarea directă (fără spălare). Numărările pe minut obținute în reacția kinazei (minus martor) sunt apoi împărțite la activitatea specifică pentru a determina molii de fosfat transferați în reacție.
cinetica fosforilării substratului
parametrii cinetici pentru fosforilarea unui substrat de către un MAPK pot fi determinați folosind o variație a Protocolului de mai sus.
1. Efectuați o reacție la o concentrație mare de substrat pentru a stabili că proteina este un substrat.
2. Variați concentrația enzimei în test. Rata de fosforilare a substratului trebuie să fie proporțională cu concentrația enzimei în condițiile testului. Acest experiment este, de asemenea, utilizat pentru a determina cantitatea de enzimă necesară pentru studiile cinetice.
pentru a determina ratele, trebuie efectuat un ciclu de timp al fosforilării substratului. În acest caz, pregătiți o reacție enzimatică mai mare (folosim 150 ul). La punctele de timp dorite, retrageți 25 de alicote ul și transferați-le în tuburi microcentrifuge care conțin 45 ul de TCA 10% rece ca gheața și analizați reacțiile așa cum este descris mai sus. Fosforilarea substratului trebuie să fie liniară în timp, iar pentru măsurarea constantelor cinetice trebuie utilizate ratele inițiale de reacție (5%).
3. Variați concentrația substratului în test. Utilizați un grafic al vitezei vs. concentrația peptidelor pentru a obține o estimare inițială a valorii Km. La această măsurare inițială trebuie utilizată o gamă largă de concentrații de substrat (de exemplu, 20 uM până la 2 mM).
4. Pentru a determina Km (substrat) și Vmax , variați concentrația substratului și măsurați viteza de transfer a fosfatului. O gamă bună de concentrații de substrat sunt următorii multipli de Km: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Reacțiile trebuie efectuate în trei exemplare pentru cele mai bune rezultate.
5. Constantele cinetice sunt determinate de cele mai mici pătrate neliniare ponderate potrivite vitezei hiperbolice față de parcele folosind programe iterative precum NFIT (produse insulare, Galveston, TX).
calculul RAR:
RAR: raport Acceptor relativ = Vmax / Km definit ca o măsură globală a capacității unei proteine de a funcționa ca substrat.
normalizez RAR al unui substrat dat cu proteina bazică a mielinei, adică calculați valoarea RAR pentru fiecare substrat și apoi împărțiți-o la valoarea RAR a proteinei bazice a mielinei (stabilind astfel MBP la 1,0).
