1. Testarea mutațiilor exonului KRAS 2 (codonii 12/13) și exonului 3 (codonul 61): testul mutației Kras Cobas pentru uz in Vitro (Roche).
testul de mutație Cobas KRAS este un test PCR în timp real pentru detectarea calitativă a mutațiilor somatice în exonul 2 (codonii 12/13) și exonul 3 (codonul 61) al genei KRAS utilizând o intrare ADN de 100 ng. Testul poate detecta 19 mutații KRAS. Prezența mutațiilor este detectată cu o specificitate analitică de cel puțin 99% și o limită de detecție de cel puțin 5% Nivel mutant într-un fundal de ADN genomic de tip sălbatic.
testul de mutație Cobas XV KRAS se bazează pe două procese majore: (1) pregătirea manuală a probelor pentru obținerea ADN-ului genomic dintr-una sau două secțiuni de țesut CRC FFPE cu grosimea de 5 mm care conțin cel puțin 10% celule tumorale; (2) amplificarea PCR a ADN-ului țintă utilizând perechi de primeri complementari și două sonde oligonucleotidice etichetate cu colorant fluorescent. Perechile de primeri utilizate definesc o secvență de 85 de perechi de baze pentru exonul 2 care conține codonii KRAS 12 și 13 și o secvență de 75 de perechi de baze pentru exonul 3 care conține codonul KRAS 61 în ADN-ul genomic uman. O sondă este proiectată pentru a detecta secvența codonului KRAS 12/13 în exonul 2, iar cealaltă sondă este proiectată pentru a detecta secvența codonului KRAS 61 în exonul 3 al genei KRAS. Detectarea mutațiilor se realizează prin analiza curbei de topire de către analizorul Cobas z 480 (1).
2. Testul de mutație KRAS v2 (LSR)
testul de mutație KRAS v2 (LSR) este un test PCR specific alelei, în timp real, pentru detectarea și identificarea calitativă a mutațiilor exonului 2, 3 și 4 în gena v-ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogen omolog (KRAS) din țesutul fixat cu formalină, încorporat în parafină (FFPET). Testul este conceput pentru a detecta 28 de mutații unice. Prezența mutațiilor este detectată cu o specificitate analitică de cel puțin 99% și o limită de detecție de cel puțin 1% nivel mutant într-un fundal de ADN genomic de tip sălbatic.
testul de mutație KRAS v2 (LSR) se bazează pe două procese: (1) pregătirea manuală a eșantionului pentru a obține ADN genomic din FFPET; și (2) amplificarea PCR și detectarea ADN-ului țintă folosind perechi de primeri complementare și sonde oligonucleotidice etichetate cu coloranți fluorescenți.
testul de mutație KRAS v2 (LSR) utilizează primeri care definesc secvențe specifice de perechi de baze pentru fiecare dintre mutațiile vizate. Amplificarea are loc numai în regiunile genei KRAS dintre primeri; întreaga genă nu este amplificată. Secvențele KRAS vizate variază între 79 – 114 perechi de baze. Detectarea mutațiilor se realizează prin analiza PCR cu analizorul Cobas z 480. (1)
3. Testul de mutație BRAF/NRAS (LSR)
testul de mutație BRAF / NRAS (LSR) este un test PCR specific alelei, în timp real, pentru detectarea și identificarea calitativă a mutațiilor exonului 11 și 15 în gena proto-oncogenă B-Raf (BRAF) și a mutațiilor exonului 2, 3 și 4 în gena neuroblastomului ras oncogen omolog viral (NRAS) din țesutul fixat cu formalină, încorporat în parafină (FFPET).
testul este conceput pentru a detecta 36 de mutații unice. Prezența mutațiilor este detectată cu o specificitate analitică de cel puțin 99% și o limită de detecție de cel puțin 5% Nivel mutant într-un fundal de ADN genomic de tip sălbatic.
testul de mutație BRAF/NRAS (LSR) se bazează pe două procese majore: (1) pregătirea manuală a eșantionului pentru a obține ADN genomic din FFPET; și (2) amplificarea PCR și detectarea ADN-ului țintă folosind perechi de primeri complementare și sonde oligonucleotidice etichetate cu coloranți fluorescenți.
testul de mutație BRAF/NRAS (LSR) utilizează primeri care definesc secvențe specifice de perechi de baze pentru fiecare dintre mutațiile vizate. Amplificarea are loc numai în regiunile genelor BRAF sau NRAS între primeri; întreaga genă nu este amplificată. Secvențele BRAF variază între 101 și 120 de perechi de baze. Secvențele ANR variază între 94 – 121 perechi de baze. Detectarea mutațiilor se realizează prin analiza PCR cu analizorul Cobas z 480. (2)
implicații clinice
KRAS și ANR sunt membri ai familiei oncogene RAS strâns legați, iar mutațiile ambelor gene la codonii 12, 13 (exonul 2), codonul 61 (exonul 3) și codonul 146 (exonul 4) determină creșterea nivelurilor de proteine RAS legate de guanozin trifosfat. Semnalizarea RAS hiperactivă promovează oncogeneza. În carcinomul colorectal (CRC), mutațiile KRAS și NRAS la acești codoni se găsesc în până la 50% din cazuri și prezic o lipsă de răspuns la terapia anti-EGFR. Majoritatea mutațiilor RAS sunt mutații punctuale care apar în exonul KRAS 2 (codonii 12 sau 13; aproximativ 40%). Alte mutații RAS sunt mai puțin frecvente, Cele mai frecvente mutații apărând în exonii KRAS 3 și 4 și exonii ANR 2 și 3 (3).
aproximativ 50% din melanoame prezintă mutații activatoare în BRAF. Peste 90% din mutațiile BRAF au ca rezultat o nucleotidă 1799 t>o modificare care duce la o substituție a acidului valină-glutamic în poziția 600 (V600E). Mutația BRAF V600E determină semnalizarea necontrolată a căii MAPK care duce la creșterea și proliferarea excesivă a celulelor. Agenții care vizează BRAF mutant activat (inhibitori BRAF) s-au dovedit a avea succes la pacienții cu melanom metastatic care adăpostesc această mutație (1-3).
în afară de valoarea sa predictivă în melanom, mutația BRAF V600E are, de asemenea, valoare prognostică în cancerul colorectal și în cancerul pulmonar (NSCLC) (4,5,7). Mutația BRAF V600E se găsește în aproximativ 10% din carcinomul colorectal metastatic și a fost asociată cu prezența instabilității microsatelitului (6). În general, pacienții cu CRC mutant BRAF au rate de răspuns scăzute la terapiile convenționale și prognostic advers. În timp ce melanoamele mutante BRAF V600 sunt sensibile la inhibitorii BRAF, CRC-urile mutante BRAF V600 pot să nu fie la fel de sensibile. Activarea EGFR în cancerul colorectal ar putea explica de ce cancerele colorectale au, în general, un răspuns mai mic la inhibitorii BRAF. Prin urmare, se recomandă inițierea terapiei combinate cu inhibitori EGFR și BRAF.
mutația BRAF V600E se găsește, de asemenea, în 3-5% din toate cazurile de cancer pulmonar (7). În timp ce inhibitorii BRAF s-au dovedit a avea succes la pacienții cu NSCLC cu mutație V600E pozitivă, FDA a aprobat utilizarea terapiei combinate cu inhibitor BRAF și MEK pentru pacienții cu NSCLC cu mutație V600E pe baza rezultatelor unui studiu internațional, multicentric, cu trei cohorte, non-randomizat, non – comparativ, deschis, la pacienții cu NSCLC metastatic pozitiv cu mutație BRAF V600E confirmat local.
cerințe privind specimenele
specimenele acceptabile pentru analiză sunt specimene de țesut de carcinom colorectal fixat cu formalină, încorporat în parafină, cu un timp de fixare de 6-48 ore.
volum
se preferă blocul de parafină reprezentativ 1. Alternativ, pentru probele de rezecție este necesar un minim de 5 secțiuni de țesut necolorat (grosime de 5 centimetri) (testare completă RAS).
instrucțiuni de depozitare și expediere
mențineți și expediați specimenele la temperatura ambiantă.
limitări
conținutul insuficient al tumorii poate să nu permită detectarea mutațiilor KRAS/NRAS/BRAF: este necesară 10% din celulele tumorale. Conținutul tumoral este evaluat înainte de analiză și se efectuează macrodisecția. Fixativele, altele decât formalina sau timpul de fixare prelungit, pot da naștere unor rezultate inadecvate.
cerințe speciale
niciuna.
timp de întoarcere
5 până la 7 zile lucrătoare pentru lamele și blocurile de parafină.
- Li și colab. Un test foarte verificat pentru detectarea mutației KRAS în țesutul și Plasma cancerului pulmonar, Colorectal și Pancreatic. Arch Pathol Lab Med. 2019 februarie;143:183-9
- Patten și colab. Un test sensibil și precis pentru detectarea simultană a 36 de mutații BRAF și NRAS. Jurnalul de Oncologie Clinică 2018 36:15
- Douillard JY și colab. Tratamentul cu Panitumumab-FOLFOX4 și mutațiile RAS în cancerul colorectal. N Engl J Med. 2013 Septembrie 12; 369 (11):1023-34.
actualizat la 03 decembrie 2019
