- Streszczenie
- 1. Wprowadzenie
- 2. Materiały i odczynniki
- 2.1. Izolacja i uprawa ludzkich komórek nabłonka limbowego
- 2.2. Test wydajności formowania Kolonii (CFE)
- 2.3. Test podwojenia populacji komórek
- 2.4. Przeprowadzono ekstrakcję RNA i ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym
- 2.5. Immunofluorescencyjne zabarwienie
- 2.6. Analiza Western Blot
- 2.7. Statystyka
- 3. Wyniki
- 3.1. Fenotyp komórek macierzystych nabłonka rogówki w pożywce SR
- 3.2. Test CFE
- 3.3. Analiza PCR i Real-Time PCR
- 3.4. Immunofluorescencyjne barwienie
- 3.5. Western Blot
- 4. Dyskusja
- konkurencyjne interesy
- podziękowania
Streszczenie
komórki nabłonka limbowego mogą być utrzymywane na warstwie podajnika 3T3 z pożywką do hodowli uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą i komórki te zostały wykorzystane do skutecznego leczenia niedoboru limbowych komórek macierzystych. Jednak płodowa surowica bydlęca zawiera nieznane składniki i wykazuje ilościowe i jakościowe różnice między partiami. W celu poprawy warunków hodowli, określono zastępowanie surowicy Nokautowej w celu zastąpienia płodowej surowicy bydlęcej w celu hodowli ludzkiej komórki nabłonka limbowego. Ludzkie pierwotne komórki nabłonka limbalowego hodowano odpowiednio w surowicy Nokautującej i pożywce uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą. Badano i porównywano tempo wzrostu komórek, ekspresję genów i utrzymanie nabłonkowych komórek macierzystych limbal. Ludzkie pierwotne komórki nabłonka limbalowego wyizolowano i pomyślnie hodowano seryjnie w tym nowym pożywce uzupełnionej surowicą Nokautową; proliferacja komórek i utrzymanie komórek macierzystych były podobne do komórek hodowanych w pożywce uzupełnionej surowicą bydlęcą płodu. Dane te sugerują, że to pożywka uzupełniona surowicą Nokautową jest skutecznym zamiennikiem tradycyjnego pożywki uzupełnionej surowicą bydlęcą płodu do hodowli komórek nabłonka limbowego, a pożywka ta ma duży potencjał do długoterminowego utrzymania komórek nabłonka limbowego, przeszczepu nabłonka limbowego komórek macierzystych i regeneracji tkanek.
1. Wprowadzenie
nabłonkowe komórki macierzyste rogówki znajdują się w warstwie podstawnej limbusa, falistej i pigmentowanej strukturze zwanej palisadami Vogta . Te komórki macierzyste podtrzymują ciągłą odnowę nabłonka rogówki przez całe życie i zastępują uszkodzone lub utracone komórki nabłonka rogówki . Niedobór komórek macierzystych Limbal (LSCD )i związane z nimi choroby powierzchni oka mogą być skutecznie leczone przy użyciu hodowlanego nabłonka limbal autografu. Sukces tych zabiegów chirurgicznych zależy od skutecznej ekspansji nabłonkowych komórek macierzystych limbal, które w większości przypadków angażują warstwę podajnika 3T3 i płodową surowicę bydlęcą (FBS). System hodowli warstw podajnika 3T3 został stworzony przez Rheinwald i Green i był z powodzeniem stosowany do rozszerzania komórek nabłonka z ludzkiej skóry, mieszków włosowych, limb, spojówek i tkanki błony śluzowej jamy ustnej . Jednak FBS nie jest dobrze zdefiniowany i zawsze wyświetla ilościowe i jakościowe różnice między partiami. FBS zawiera również potencjalnie szkodliwe składniki ksenogeniczne, które mogą stymulować reakcje immunologiczne i przenosić choroby zwierząt i patogeny . W związku z tymi wszystkimi obawami rośnie potrzeba opracowania dobrze zdefiniowanego medium hodowlanego w celu zastąpienia tradycyjnego pożywki uzupełnionej FBS.
obecnie istnieją pewne wolne od surowicy alternatywne media do wzrostu komórek nabłonkowych, takie jak zdefiniowane pożywki bez surowicy keratynocytów (KSFM™, Invitrogen, USA), pożywki do wzrostu keratynocytów (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) i pożywki Progenitor Cell Targeted (PCT) (CellnTEC™, Szwajcaria). Wykazano, że produkty te wspomagają ekspansję komórek nabłonka rogówki. Jednak nadal potrzebują suplementów niezdefiniowanych produktów, takich jak ekstrakt przysadki bydlęcej (BPE) lub albumina surowicy ludzkiej (HAS). Większość z tych mediów wymaga dużej gęstości wysiewu komórek, co może nie być praktyczne dla ekspansji ludzkich komórek nabłonka rogówki. Ponadto nabłonkowe komórki macierzyste rogówki, które są wykrywane jako holoclony w systemie hodowli 3T3, nie mogły być utrzymywane w tej hodowli bez surowicy przez dłuższy czas . Do tej pory nie ma zdefiniowanego pożywki bez surowicy, która mogłaby wspierać ekspansję nabłonkowych komórek macierzystych rogówki przez długi czas.
KnockOut serum replacement (SR) to zdefiniowany preparat bez surowicy, który został zaprojektowany, aby bezpośrednio zastąpić FBS w celu utrzymania embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). Wykazano, że KnockOut SR zapewnia spójne warunki wzrostu dla komórek ES i kultury iPSC, a komórki ES uprawiane w pożywce uzupełnionej KnockOut SR są znacznie mniej zróżnicowane niż te uprawiane w pożywce uzupełnionej FBS, a transmisja linii zarodkowej nie jest w najmniejszym stopniu zagrożona. Biorąc pod uwagę podobieństwa w metodach hodowli komórek nabłonkowych i komórek ES oraz w świetle faktu zastępowania FBS przez KnockOut SR w hodowli komórek ES, tutaj istnieje hipoteza, że KnockOut SR może być użyty do zastąpienia FBS w hodowli komórek nabłonkowych limbal.
2. Materiały i odczynniki
naczynia do hodowli komórkowej, kolby, probówki do wirówek i pipety serologiczne zakupiono od firmy Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco 's Modified Eagle’ s Medium (DMEM), Ham ’ S F-12, HEPES, penicylina i streptomycyna, L-Glutamina, 0,05% trypsyna-0.02% roztwór EDTA, zestaw Superscript III i zestaw RNeasy™ zostały nabyte z Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Płodowa surowica bydlęca (FBS) została zakupiona od Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Mysich fibroblastów NIH 3T3 (ATCC CCL 92) uzyskano z amerykańskiej kolekcji kultur typu (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II pochodził z Roche. Przeciwciała monoklonalne (MAB) przeciwko ABCG2 (klon BXP-21) i connexin 43 pochodziły z Millipore; p63 (klon 4A4), K5 i K19 pochodziły z Santa Cruz; K3 mAb (klon AE5) pochodziło z ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-skoniugowane kozie przeciwciało wtórne przeciw myszom pochodziło z Invitrogenu-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Zestawy GeneAmp RNA-PCR i TaqMan Universal PCR Master Mix AMPERASE UNG pochodziły z Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycyna C, insulina bydlęca, ludzka transferryna, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGF), Toksyna cholery i inne odczynniki pochodziły z Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Izolacja i uprawa ludzkich komórek nabłonka limbowego
pierścienie rogówki-limb zostały zebrane od pięciu zdrowych dawców tuż po przeszczepieniu rogówki, uzyskano świadomą zgodę, a protokół pobierania próbek został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu w Jilin. Świeże pierścienie rogówki i limby potraktowano 0,25% Dispase II w 4°C przez noc, a warstwę nabłonkową usunięto z leżącej poniżej tkanki zrębu i potraktowano 0,05% trypsyny-0,02% EDTA w 37°C przez 15 minut. Aktywność trypsyny zneutralizowano o 10% FBS i zebrano dysocjowane komórki nabłonka limbowego i odwirowano przy 1500 obr. / min przez 5 minut. Żywotność komórek nabłonkowych oznaczano za pomocą błękitu trypanowego, z wyłączeniem barwienia, a liczbę komórek zliczano za pomocą hemocytometru.
fibroblasty myszy 3T3 utrzymywano w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco Eagle (dmem, wysoka glukoza), uzupełnionej 10% FBS, L-glutaminą (2 mM) i penicyliną-streptomycyną (50 J.M./mL) i hodowano w 5% CO2 i w wilgotnej atmosferze. Komórki 3T3 subkulturowano co 6 dni, osiągając 80-90% zbiegu. Komórki 3T3 utrzymywano seryjnie i tylko komórki przed przejściem 20 były używane do przygotowania warstwy podajnika. W celu wytworzenia warstwy podajnika, komórki 3T3 zbiegu potraktowano mitomycyną C (10 µg/mL) przez 2 godziny w temperaturze 37°C, dwukrotnie przemyto PBS i potraktowano 0,05% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37°C. następnie zebrano fibroblasty 3T3 i posmarowano je gęstością 30 000 komórek/cm2 jeden dzień przed wysiewem komórek nabłonkowych.
ludzkie komórki nabłonka limbalowego hodowano na warstwie podajnika 3T3 przy użyciu pożywki FAD lub pożywki zastępującej surowicę (SR). Pożywka FAD jest mieszaniną DMEM i pożywki F-12 Ham (1 : 1) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, L-glutaminę (2 mM) i penicylinę-streptomycynę (50 J.M./mL), czynnik wzrostu naskórka (10 ng/mL), insulinę (5 µg/mL), adeninę (0,18 mM), hydrokortyzon (0,4 µg/mL), toksynę cholery (0,1 nM) i trijodotyroninę (2 nM). Pożywka SR jest mieszaniną pożywki Dmem i Ham ’ s F-12 (1 : 1) zawierającą 10% substytut surowicy SR, L-glutaminę (2 mM) i penicylinę-streptomycynę (50 J.M./mL), czynnik wzrostu naskórka (10 ng/mL), insulinę (5 µg/mL), adeninę (0,18 mM), hydrokortyzon (0.4 µg/mL), Toksyna cholery (0,1 nM), trijodotyronina (2 nM), transferryna (5 µg/mL) i selen (5 ng/mL). Komórki nabłonka limbalnego zaszczepiono na warstwie podajnika 3T3 o gęstości 6000 komórek / cm2 i hodowano z 5% CO2 i wilgotną atmosferą. Środek FAD był zmieniany co 3 dni, podczas gdy środek SR był zmieniany co 2 dni.
2.2. Test wydajności formowania Kolonii (CFE)
dla testu CFE, 200 ludzkich komórek nabłonka limbowego z hodowli FAD lub hodowli SR pokryto na szalce Petriego o grubości 100 mm zawierającej podajnik 3T3 traktowany mitomycyną C i hodowano zgodnie z opisem powyżej. Po 12-dniowej hodowli potrawy utrwalano 10% formaliną przez 30 minut w temperaturze pokojowej i barwiono 1% Rodaminą B przez kolejne 30 minut. Po umyciu wodą destylowaną liczono i analizowano liczbę kolonii. Efektywność tworzenia kolonii wyrażono jako liczbę utworzonych Kolonii podzieloną przez 200.
2.3. Test podwojenia populacji komórek
komórek nabłonka Limbalowego utrzymywano na warstwie podajnika 3T3 traktowanej mitomycyną C przy użyciu pożywki FAD lub pożywki SR. Komórki nabłonkowe trypsynizowano po osiągnięciu 80-90% zbiegu i przepuszczano przy gęstości 6000 komórek / cm2. Kultury były utrzymywane seryjnie przez 10 fragmentów. Przy każdym przejściu pobierano komórki nabłonka limbowego i zliczano numery komórek. Liczbę podwojeń populacji (PD) dla każdego przejścia obliczono według następującego wzoru: , gdzie oznacza całkowitą liczbę komórek uzyskanych przy każdym przejściu i reprezentuje liczbę komórek galwanicznych na początku.
2.4. Przeprowadzono ekstrakcję RNA i ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym
w celu oceny poziomu ekspresji genów komórek nabłonka limbowego, PCR i PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA wyekstrahowano z komórek nabłonka rogówki za pomocą zestawu RNeasy zgodnie z instrukcjami producenta. RNA oznaczano ilościowo przez jego absorpcję przy 260 nm i przechowywano w temperaturze -80°C. Do syntezy cDNA użyto 1 µg całkowitego RNA z zestawem odwrotnej transkrypcji Superscript III. PCR wykonano przy użyciu Platinum PCR master mix (Life Technology), A PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu SYBR Green PCR Master Mix (Roche) z wcześniej opisanymi starterami . Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono w trzech egzemplarzach z początkowym etapem aktywacji w temperaturze 95 ° C przez 3 minuty, a następnie przeprowadzono 45 cykli: 95°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 40 sekund. Względna ekspresja genów została obliczona poprzez normalizację różnicy wartości progowych cyklu (delta Ct), wartości genów do wartości delta ct dehydrogenazy gliceraldehydowo-3-fosforanowej (GAPDH).
2.5. Immunofluorescencyjne zabarwienie
ludzkich komórek nabłonka limbowego zaszczepiono w szkiełkach hodowlanych z warstwą podajnika 3T3 w pożywce FAD lub pożywce SR. Trzy dni po wysiewie Kultury utrwalano 4% paraformaldehydem lub zimnym acetonem w temperaturze 4°C przez 10 minut. Po dwukrotnym umyciu PBS komórki blokowano 5% serum koziego w PBS przez 30 minut. Mysie pierwotne przeciwciała przeciwko p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) i connexin 43 (1: 1000, Millipore) nanoszono i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. przeciwciało wtórne sprzężone z Alexa Fluor 568 nanoszono przez 1 godzinę po dwukrotnym przemyciu PBS. Następnie jądra komórkowe przeciwstawiano Hoechst 33342 (1 µg / mL w PBS) przez 20 minut. Po 3-krotnym umyciu PBS hodowlę komórkową zamontowano za pomocą podłoża montażowego (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym (BX50; Olympus, Tokio, Japonia).
2.6. Analiza Western Blot
hodowane komórki nabłonka limbowego lizowano buforem RIPA (10 mM tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% deoksycholanu sodu, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA i koktajl inhibitora proteazy; Roche Diagnostics) na lodzie przez 30 minut. Stężenie białka oznaczano ilościowo za pomocą testu białka kwasu bicynchoninowego (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Całkowite lizaty komórkowe (40 µg) poddano elektroforezie w 12% gradientowym żelu SDS-PAGE, przeniesiono do błony nitrocelulozowej (Bio-Rad), Zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej przez Tris (TBS) na 1 godzinę i zbadano mysimi przeciwciałami przeciwko antygenowi jądra komórkowego proliferującego (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) lub p63 (4A4, Santa Cruz, CA) przez noc w temperaturze 4°C. trzy razy przemyte TBS, inkubowane z kozim anty-mysim IgG (1 : 5000, Koniugowany HRP, Santa Cruz, CA) lub króliczym anty-kozim IgG (1 : 5000, HRP-sprzężone, Santa Cruz, CA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i opracowane z ulepszonymi substratami chemiluminescencyjnymi (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Poziomy ekspresji ABCG2, PCNA i p63 mierzono za pomocą pomiaru intensywności półprzezroczystej i znormalizowano do poziomu GAPDH, który służył jako kontrola wewnętrzna.
2.7. Statystyka
podsumowanie danych CFE i względnej krotności PCR w czasie rzeczywistym zostało zgłoszone jako średnia ± SD i porównane za pomocą testu niesparowanego ucznia z Microsoft Excel (Wersja 2003/XP). Wyniki testu zostały przedstawione jako wartości dwuogonowe, gdzie uznano je za istotne statystycznie.
3. Wyniki
3.1. Fenotyp komórek macierzystych nabłonka rogówki w pożywce SR
pobrano od dawców w przedziale wiekowym 32-65 lat łącznie 5 tkanek pierścienia rogówkowo-wargowego. Tkanki te zostały zakonserwowane i przetworzone w ciągu 24 godzin po zbiorze. Hodowlę pierwotnych komórek nabłonka rogówki u człowieka przeprowadzono również w pożywce FAD(Fig.1(A) i 1 (b)) oraz pożywce SR(Fig. 1(c) i 1 (d)). Komórki nabłonka rogówki utrzymywane w warstwie podajnika SR medium + 3T3 wykazywały morfologię o niewielkich rozmiarach i wysokim stosunku jąder / cytoplazmy, co było typową morfologią niezróżnicowanych komórek nabłonkowych, a Duże różnicujące się płaskie komórki płaskonabłonkowe rzadko obserwowano (Fig. 1 (c)). Komórki nabłonkowe utrzymywane w pożywce SR zaczęły tworzyć kolonie 3 dni po wysiewie (Fig.1(c)). Rozmiary tych kolonii były podobne do tych utworzonych w warstwie podajnika fad medium + 3T3(Fig.1 (A)), ale kolonie te były mniej zwarte niż te w warstwie podajnika FAD + 3T3. W ciągu 7 dni komórki nabłonkowe osiągnęły zbieg w pożywce SR o jednorodnych małych rozmiarach (Fig. 1 (d)), co zaobserwowano również w hodowli FAD(Fig.1 (b)). W tym badaniu ludzkie komórki nabłonka rogówki mogły być pozyskiwane i utrzymywane w warstwie podajnika SR + 3T3 dla wszystkich pięciu dawców. W przypadku długotrwałej uprawy komórki nabłonka rogówki ludzkiej poddano szeregowej subkulturze w warstwie SR + 3T3 przez ponad 10 przejść (). Podczas każdego przejścia komórki trypsynizowano i zbierano, gdy komórki osiągnęły 80-90% zbiegu; liczbę komórek obliczano dla testu podwojenia populacji. Wynik pokazuje, że wydajność komórek nabłonkowych z pożywki SR jest zbliżona do wydajności komórek hodowanych w pożywce FAD, jak pokazano na fig .2(a), A Dane te są podobne do poprzednich raportów. Podsumowując, dane przedstawione tutaj pokazują, że podłoże hodowlane SR + podajnik 3T3 potraktowany mitomycyną C wspomaga klonalny wzrost i proliferację komórek nabłonka rogówki.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Test CFE
następnie zbadaliśmy i porównaliśmy CFE komórek nabłonka rogówki hodowanych w pożywce FAD i SR. W celu analizy CFE, komórki nabłonka rogówki hodowane w pożywce SR i FAD zebrano i wysiewano z gęstością 200 komórek na 100 mm szalkę Petriego, która była wcześniej podawana warstwą podajnika 3T3 poddaną działaniu mitomycyny C, i hodowlę tę pozostawiono do wzrostu przez 12 dni. Komórki nabłonka rogówki zaczęły tworzyć kolonie 5-7 dni po rozpoczęciu hodowli. Jak pokazano na fig. 2 (b), po hodowaniu przez 12 dni komórki nabłonka rogówki utrzymywane w pożywce SR wykazywały podobne CFE i wielkość Kolonii w porównaniu z komórkami utrzymywanymi w pożywce FAD. Wartość CFE dla komórek nabłonka w pożywce SR i fad wynosiła odpowiednio i (fig. 2 (c)). Analiza statystyczna wykazała, że nie ma znaczących różnic w wydajności tworzenia kolonii () i średniej powierzchni Kolonii () między SR i fad media(Rysunek 2 (c)). Określiliśmy procent typów kolonii na podstawie powierzchni Kolonii. Wyniki wykazały, że odsetek Kolonii poronionych (powierzchnia Kolonii <1 mm2) utworzonych w środowisku SR był podobny do tego w środowisku FAD (). Podobnie odsetek dużych kolonii (powierzchnia Kolonii >4 mm2) utworzonych w środowisku SR był zbliżony do tego w środowisku FAD () (Rysunek 2(D)). Wyniki te wskazują, że komórki nabłonka rogówki hodowane w pożywce SR mają podobny wyższy stopień potencjału proliferacyjnego w porównaniu z komórkami hodowanymi w pożywce FAD.
3.3. Analiza PCR i Real-Time PCR
w celu zbadania ekspresji genu, PCR i real-time PCR przeprowadzono na komórkach nabłonkowych hodowanych zarówno w mediach FAD, jak i SR. Jako kontrolę wewnętrzną wykorzystano gene GAPDH. Dane PCR pokazują, że komórki hodowane zarówno w pożywce FAD, jak i pożywce SR wykazują ekspresję transkryptu wysokiego poziomu markera proliferacyjnego PCNA. Komórki w obu mediach wykazują pozytywną ekspresję cytokeratyny 3 i cytokeratyny 12, co jest zgodne z ich pochodzeniem limbus. W obu kulturach zaobserwowano również pozytywną ekspresję markera komórek nabłonkowych warstwy podstawnej, cytokeratyny 15. Ekspresja Abcg2 i ΔNp63α została wykryta w obu kulturach, chociaż ekspresja Abcg2 zmniejszyła się nieznacznie po hodowli pierwotnej w środowisku SR. Niski poziom ekspresji connexin 43 zaobserwowano w obu kulturach i sugerował niski poziom różnicowania komórek nabłonkowych w obu mediach. W przypadku PCR w czasie rzeczywistym analiza ilościowa poziomu mRNA wykazała, że nie ma znaczącej różnicy ekspresji () p63 i ABCG2 między komórkami nabłonkowymi wyhodowanymi w pożywkach FAD i SR (Fig.4(A)). Przeprowadzono również w czasie rzeczywistym analizę markera różnicowania nabłonka rogówki cytokeratyny 3 i cytokeratyny 12. Oba te dwa markery były ledwo wykrywalne zarówno w hodowlach komórek FAD, jak i SR, i, co zaskakujące, nie ma znaczącej różnicy () w poziomie ekspresji między tymi dwoma kulturami.
3.4. Immunofluorescencyjne barwienie
aby potwierdzić, że komórki nabłonkowe wyhodowane w pożywce SR utrzymywały stemness i niezróżnicowany stan, przeprowadzono immunofluorescencyjne barwienie kilku proliferacji, różnicowania i domniemanych markerów komórek macierzystych nabłonka. Jak pokazano na fig. 4, w środowisku SR większość komórek nabłonkowych wykazywała małą i jednolitą morfologię, a większość komórek była silnie zabarwiona p63, przypuszczalnym markerem komórek macierzystych nabłonka. Dodatnie zabarwione komórki ABCG2 obserwowano również w niejednorodnym rozkładzie w obrębie Kolonii komórek nabłonka limbowego. Komórki utrzymywane w środowisku SR były słabo wybarwione dla connexin 43 i cytokeratyny 3. Niska ekspresja tych dwóch markerów różnicowania sugeruje niski poziom różnicowania komórek nabłonkowych w hodowli komórkowej. Podobny styl barwienia zaobserwowano również w komórkach utrzymywanych z pożywką FAD (Fig. 4 (b)). Dane te sugerują, że ludzkie komórki nabłonka limbalnego hodowane w SR medium utrzymywały wysoki poziom ekspresji domniemanych markerów komórek macierzystych nabłonka, podczas gdy wyrażały niski poziom markerów różnicowania.
3.5. Western Blot
aby dwukrotnie potwierdzić ilościową ekspresję genu i wyniki immunofluorescencyjnego barwienia, oceniano ekspresję potencjalnych markerów komórek macierzystych nabłonka (P63 i ABCG2) i markera proliferacji (PCNA) przy użyciu western blot. Stosując monoklonalne przeciwciało p63 (klon 4A4, Santa Cruz), białko p63 (70 KD, izoforma ΔNα) wykryto na wysokim poziomie ekspresji w pożywce SR. Ekspresję ABCG2 (70 KD) wykryto w każdym przejściu komórek hodowanych w pożywce SR. PCNA, marker proliferacji, Wykryto również w komórkach hodowanych w pożywce SR (Fig. 3 (c)). Poziomy ekspresji p63, ABCG2 i PCNA były podobne w 10 fragmentach z pomiarem intensywności półprzezroczystej (Fig. 3 (d)) przy użyciu GAPDH jako kontroli wewnętrznej.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Dyskusja
komórki nabłonkowe hodowane na warstwie podajnika 3T3 zostały z powodzeniem pozyskane i stosowane w leczeniu różnych sytuacji klinicznych, takich jak ciężkie oparzenia, owrzodzenia stopy cukrzycowej, wady skóry i wady błony śluzowej jamy ustnej . Pierwszy przeszczep nabłonkowych komórek macierzystych limbal został opisany w 1997 roku przez Pellegriniego i wsp. . W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka różnych metod hodowli, w tym hodowlę komórek nabłonka limbal na ludzkiej błonie owodniowej (HAM) z warstwą podajnika 3T3 lub bez niej , hodowlę komórek nabłonka na płytkach reagujących na temperaturę i hodowlę komórek nabłonka z komercyjnym pożywką wolną od surowicy. Ponieważ niedawny raport wskazuje, że wynik kliniczny przeszczepu komórek nabłonkowych rogówki/limbusa zależy od tego, czy komórki macierzyste limbalne są zachowane w hodowli komórkowej, zwrócono uwagę, że holoclony zostały zachowane tylko w systemie hodowli FAD + 3T3 . Ponieważ ten protokół hodowli obejmuje stosowanie FBS, rośnie obawa o bezpieczeństwo, że FBS jest słabo zdefiniowanym produktem zwierzęcym i może przenosić choroby pochodzenia zwierzęcego na pacjentów . W związku z tym rośnie potrzeba opracowania pożywki hodowlanej wolnej od produktów zwierzęcych i wolnej od FBS w celu zastąpienia tradycyjnego pożywki FAD .
w tym badaniu opracowaliśmy nowatorski środek do hodowli bez surowicy, w którym KnockOut SR zastąpił FBS. Fenotypy nabłonkowych komórek macierzystych limbal w tej nowej pożywce hodowlanej wolnej od surowicy oceniano przez immunostaining przeciwciałami dla proponowanych markerów komórek macierzystych (P63, ABCG2) i markerów różnicowania (cytokeratyna 3, connexin 43).
czynnik transkrypcji jądrowej p63 był wcześniej proponowany jako marker nabłonkowych komórek macierzystych, a ΔNα jest dominującą izoformą izoform p63 w tych komórkach . Nasze wyniki są zgodne z poprzednimi raportami; jądrowy p63 był silnie wyrażony w hodowli komórek limbalnych, co zostało wykazane przez immunostaining, real-time PCR i Western blot. Obecność p63 w hodowli komórek limbalnych wskazuje na ich wysoki potencjał proliferacyjny i samoodnawialny. ABCG2, członek ATP wiążącej kasety (ABC) transportery, pierwotnie znany jako rak piersi odporne białko 1 (BCRP1), został zaproponowany jako inny przypuszczalny marker komórek macierzystych dla dorosłych komórek macierzystych, w tym Limbus nabłonkowe komórki macierzyste . Wysoka ekspresja ABCG2 w pożywce SR została potwierdzona przez immunostaining i real-time PCR.
K3 i K12 są dobrze znane jako markery specyficzne dla rogówki . Konsekwentnie, nasze wyniki immunostaining i real-time PCR wykazały, że komórki były ujemne K3 i K12, potwierdzając ich pochodzenie limbus. Connexin 43 należy do rodziny białek Gap junction; umożliwia bezpośrednią dyfuzję substancji rozpuszczonych o niskiej masie cząsteczkowej między sąsiednimi komórkami. Stwierdzono , że Connexin 43 ulega ekspresji przez zróżnicowane komórki nabłonkowe, a brak tych cząsteczek komunikacji międzykomórkowej może być cechą nabłonkowych komórek macierzystych.
w naszych wynikach większy odsetek komórek wyrażał p63 i ABCG2, podczas gdy kilka komórek wykazuje ekspresję markerów różnicowania K3 / K12 i CX43. Tak więc ludzkie nabłonkowe komórki macierzyste w środowisku wolnym od surowicy SR wykazują podobne fenotypy i utrzymują niezróżnicowane warunki w porównaniu do środowiska FBS.
podsumowując, wykorzystując KnockOut SR zastępujący FBS, nasze nowatorskie medium bez surowicy utrzymuje wzrost i proliferację ludzkich komórek nabłonkowych rogówki i zachowuje nabłonkowe komórki macierzyste w ich niezróżnicowanym fenotypie. Ta nowa metoda hodowli bez surowicy jest zdefiniowana jako uzupełnienie i stosunkowo łatwa do kontrolowania. Ma duży potencjał do zastosowania w klinice transplantacji komórek nabłonkowych limbal i regeneracji tkanek.
konkurencyjne interesy
autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów.
podziękowania
praca ta była wspierana przez grant Uniwersytetu Jilin i National Natural Science Foundation Of China (NSFC 30500548).
