1. Badanie mutacji w eksonie KRAS 2 (kodony 12/13) i eksonie 3 (kodon 61): Cobas ® KRAS Mutation Test for in Vitro Diagnostic use (Roche).
Test Cobas® KRAS Mutation Test jest testem PCR w czasie rzeczywistym do jakościowego wykrywania mutacji somatycznych w eksonie 2 (kodony 12/13) i eksonie 3 (kodon 61) genu KRAS przy użyciu wejścia DNA 100 ng. Test może wykryć 19 mutacji KRAS. Obecność mutacji wykrywa się z analityczną swoistością wynoszącą co najmniej 99% i granicą wykrywalności wynoszącą co najmniej 5% poziomu mutacji na tle genomowego DNA typu dzikiego.
Test mutacji Cobas® KRAS opiera się na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu uzyskania genomowego DNA z jednego lub dwóch odcinków tkanki FFPE CRC o grubości 5 µm zawierających co najmniej 10% komórek nowotworowych; (2) amplifikacji PCR docelowego DNA przy użyciu komplementarnych par starterów i dwóch sond oligonukleotydowych oznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Używane pary starterów definiują sekwencję 85 par zasad dla eksonu 2 zawierającego kodony KRAS 12 i 13 oraz sekwencję 75 par zasad dla eksonu 3 zawierającego kodon KRAS 61 w ludzkim genomowym DNA. Jedna sonda jest zaprojektowana do wykrywania sekwencji kodonu KRAS 12/13 w eksonie 2, a druga sonda jest zaprojektowana do wykrywania sekwencji kodonu KRAS 61 w eksonie 3 genu KRAS. Wykrywanie mutacji uzyskuje się poprzez analizę krzywej topnienia za pomocą analizatora Cobas z 480 (1).
2. KRAS Mutation Test v2 (LSR)
KRAS Mutation Test v2 (LSR) jest specyficznym dla alleli, testem PCR w czasie rzeczywistym do jakościowego wykrywania i identyfikacji mutacji eksonu 2, 3 i 4 w genie V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) z tkanki utrwalonej formaliną, osadzonej parafiną (FFPET). Test ma na celu wykrycie 28 unikalnych mutacji. Obecność mutacji wykrywa się z analityczną swoistością wynoszącą co najmniej 99% i granicą wykrywalności wynoszącą co najmniej 1% poziomu mutacji na tle genomowego DNA typu dzikiego.
test mutacji KRAS V2 (LSR) opiera się na dwóch procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu uzyskania genomowego DNA z FFPET; oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA przy użyciu komplementarnych par starterów i sond oligonukleotydowych oznaczonych barwnikami fluorescencyjnymi.
test mutacji KRAS v2 (LSR) wykorzystuje startery, które definiują specyficzne sekwencje pary zasad dla każdej z docelowych mutacji. Amplifikacja występuje tylko w regionach genu KRAS między starterami; cały gen nie jest amplifikowany. Ukierunkowane sekwencje KRAS wahają się od 79-114 par zasad. Wykrywanie mutacji uzyskuje się poprzez analizę PCR za pomocą analizatora Cobas z 480. (1)
3. BRAF/NRAS Mutation Test (LSR)
BRAF/NRAS Mutation Test (LSR) jest specyficznym dla alleli testem PCR w czasie rzeczywistym służącym do jakościowego wykrywania i identyfikacji mutacji w eksonie 11 i 15 w genie protoonkogenowym B-Raf (BRAF) oraz mutacji w eksonie 2, 3 i 4 w genie neuroblastoma RAS viral oncogene homolog (NRAS) z tkanki utrwalonej formaliną, osadzonej parafiną (FFPET).
test ma na celu wykrycie 36 unikalnych mutacji. Obecność mutacji wykrywa się z analityczną swoistością wynoszącą co najmniej 99% i granicą wykrywalności wynoszącą co najmniej 5% poziomu mutacji na tle genomowego DNA typu dzikiego.
test mutacji BRAF/NRAS (LSR) opiera się na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu uzyskania genomowego DNA z FFPET; oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA przy użyciu komplementarnych par starterów i sond oligonukleotydowych oznaczonych barwnikami fluorescencyjnymi.
test mutacji BRAF/NRAS (LSR) wykorzystuje startery, które definiują specyficzne sekwencje pary zasad dla każdej z docelowych mutacji. Amplifikacja zachodzi tylko w regionach genów BRAF lub NRAS pomiędzy starterami; cały gen nie jest amplifikowany. Sekwencje BRAF wahają się od 101 do 120 par zasad. Sekwencje NRAS wahają się od 94 do 121 par zasad. Wykrywanie mutacji uzyskuje się poprzez analizę PCR za pomocą analizatora Cobas z 480. (2)
implikacja kliniczna
KRAS i NRA są blisko spokrewnionymi członkami rodziny onkogenów RAS, a mutacje w obu genach w kodonach 12, 13 (ekson 2), kodonie 61 (ekson 3) i kodonie 146 (ekson 4) powodują zwiększenie stężenia białek RAS związanych z guanozynotrifosforanem. Nadaktywna sygnalizacja RAS sprzyja onkogenezie. W raku jelita grubego (CRC) mutacje KRAS i NRAS w tych kodonach występują do 50% przypadków i przewidują Brak odpowiedzi na leczenie anty-EGFR. Większość mutacji RAS to mutacje punktowe występujące w eksonie 2 KRAS (kodony 12 lub 13; około 40%). Inne mutacje RAS są rzadsze z najczęstszymi mutacjami występującymi w eksonach KRAS 3 i 4 oraz EKSONACH NRAS 2 i 3 (3).
około 50% czerniaków zawiera mutacje aktywujące BRAF. Ponad 90% mutacji BRAF powoduje zmianę nukleotydu 1799 T>prowadzącą do podstawienia waliny do kwasu glutaminowego w pozycji 600 (V600E). Mutacja BRAF V600E powoduje niekontrolowaną sygnalizację szlaku MAPK prowadzącą do nadmiernego wzrostu i proliferacji komórek. Leki ukierunkowane na aktywowany zmutowany BRAF (inhibitory BRAF) okazały się skuteczne u pacjentów z przerzutowym czerniakiem zawierającym tę mutację (1-3).
oprócz wartości prognostycznej w czerniaku, mutacja BRAF V600E ma również wartość prognostyczną w raku jelita grubego i raka płuc (NSCLC) (4,5,7). Mutacja BRAF V600E występuje u około 10% przerzutowego raka jelita grubego i jest związana z obecnością niestabilności mikrosatelitów (6). Ogólnie rzecz biorąc, pacjenci z BRAF mutant CRC mają niski odsetek odpowiedzi na konwencjonalne terapie i niekorzystne rokowanie. Podczas gdy zmutowane czerniaki BRAF V600 są wrażliwe na inhibitory BRAF, zmutowane CRC BRAF V600 mogą nie być tak wrażliwe. Aktywacja EGFR w raku jelita grubego może wyjaśniać, dlaczego nowotwory jelita grubego generalnie wykazują mniejszą odpowiedź na inhibitory BRAF. Dlatego zaleca się rozpoczęcie leczenia skojarzonego inhibitorami EGFR i BRAF.
mutacja BRAF V600E występuje również w 3-5% wszystkich nowotworów płuc (7). Chociaż inhibitory BRAF okazały się skuteczne u pacjentów z NSCLC z mutacją V600E, FDA zatwierdziła stosowanie terapii skojarzonej z inhibitorem BRAF i mek u pacjentów z NSCLC z mutacją V600E w oparciu o wyniki Międzynarodowego, wieloośrodkowego, trzykohortowego, nieporównawczego, otwartego badania u pacjentów z miejscowo potwierdzonym NSCLC z mutacją BRAF V600E z przerzutowym NSCLC.
wymagania dotyczące próbek
dopuszczalne próbki do badania to utrwalone formaliną, osadzone parafiną próbki tkanek raka jelita grubego z czasem utrwalenia wynoszącym 6-48 godzin.
objętość
1 reprezentatywny blok parafinowy jest preferowany. Alternatywnie, w przypadku próbek do resekcji wymagane jest co najmniej 5 nieutwardzonych sekcji tkanki (grubość 5 µm) (pełne badanie RAS).
instrukcje przechowywania i wysyłki
utrzymuj i wysyłaj próbki w temperaturze otoczenia.
ograniczenia
niewystarczająca zawartość guza może nie pozwolić na wykrycie mutacji KRAS/NRAS/BRAF: wymagane jest 10% komórek nowotworowych. Zawartość guza jest oceniana przed analizą i makrodissekcja jest wykonywana. Środki utrwalające inne niż formalina lub przedłużony czas wiązania mogą powodować niewystarczające wyniki.
wymagania specjalne
brak.
czas realizacji zamówienia
od 5 do 7 dni roboczych dla prowadnic i bloków parafinowych.
- Li i in. Wysoce zweryfikowany test wykrywania mutacji KRAS w tkance i osoczu raka płuc, jelita grubego i trzustki. Arch Pathol Lab Med. 2019 luty;143:183-9
- Patten et al. Czuły i dokładny test do jednoczesnego wykrycia 36 mutacji BRAF i NRAS. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard JY et al. Panitumumab-leczenie FOLFOX4 i mutacje RAS w raku jelita grubego. N Engl J Med. 2013 Sep 12;369(11):1023-34.
Zaktualizowano 03 grudzień 2019
