długotrwała dieta ketogeniczna indukuje kwasicę metaboliczną, niedokrwistość i stres oksydacyjny u zdrowych szczurów Wistar

Streszczenie

Tło. Dieta ketogeniczna była stosowana jako terapia wspomagająca w wielu stanach, w tym w padaczce, cukrzycy i raku. Cel. Badanie to miało na celu zbadanie wpływu długotrwałego spożywania diety ketogenicznej na gaz we krwi, profile hematologiczne, funkcje narządów i poziom dysmutazy ponadtlenkowej w modelu szczura. Materiały i metody. Piętnaście samców szczura Wistar podzielono na grupy kontrolne (N = 8) i ketogeniczne (N = 7). Kontrola otrzymała standardową dietę zawierającą 52,20% węglowodanów, 7,00% tłuszczu i 15,25% białka; tymczasem Grupa ketogeniczna otrzymała dietę o wysokiej zawartości tłuszczu i niskiej zawartości węglowodanów, która zawierała 5,66% węglowodanów, 86,19% tłuszczu i 8,15% białka. Wszystkie szczury były trzymane w klatkach pojedynczo i otrzymywały 30 g standardowych lub wysokotłuszczowo-niskowęglowodanowych granulek. Eksperyment przeprowadzono przez 60 dni przed pobraniem próbek krwi i analizą w celu uzyskania poziomu gazu we krwi, liczby komórek, biomarkerów narządów i poziomu dysmutazy ponadtlenkowej przeciwutleniacza w osoczu (SOD). Wyniki. U szczurów poddanych diecie ketogennej zaobserwowano znaczne zmniejszenie masy ciała, cukru we krwi i zwiększenie stężenia ketonów we krwi (). Średnie pH krwi wynosiło 7,36 ± 0,02, a nadmiar zasadowy -5,57 ± 2,39 mOsm / L, co było istotnie niższe niż w grupie kontrolnej (). Analiza hematologiczna wykazała znacznie niższy poziom erytrocytów, hemoglobiny i hematokrytu. Nie stwierdzono istotnych zmian w stężeniach aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowej, mocznika i kreatyniny, wskazujących na prawidłowe funkcjonowanie wątroby i nerek. Niemniej jednak poziom SOD w osoczu znacznie zmniejszył się dzięki diecie ketogenicznej. Wniosek. Długotrwała dieta ketogeniczna indukuje kwasicę metaboliczną, niedokrwistość i obniżony poziom enzymów przeciwutleniających u szczurów po 60 dniach spożywania diety o wysokiej zawartości tłuszczu i niskiej zawartości węglowodanów.

1. Wprowadzenie

dieta ketogeniczna to schemat żywności, który składa się z wysokiego stężenia tłuszczu, o umiarkowanej/niskiej zawartości białka i bardzo niskiej zawartości węglowodanów. Ten rodzaj diety powoduje wysoką produkcję ciał ketonowych pochodzących z rozkładu tłuszczu do produkcji energii . Niektóre badania pokazują, że dieta ketogeniczna ma korzyści terapeutyczne w wielu chorobach. Jest zalecany jako terapia uzupełniająca w zespole policystycznych jajników, trądziku, raku i niewydolności oddechowej . Jest również korzystne jako leczenie przeciwdrgawkowe w celu zmniejszenia częstości napadów u osób z padaczką . Dieta ketogeniczna może również pomóc obniżyć poziom HbA1C u osób z cukrzycą typu 2, utrzymać stabilność nastroju u osób z chorobą afektywną dwubiegunową i obniżyć poziom cholesterolu u otyłych pacjentów .

badanie kliniczne wykazało, że krótkotrwała dieta ketogenna przez 14 dni może zwiększyć stężenie ciał ketonowych we krwi, ale także poprawić zdolność antyoksydacyjną krwi, co przyczynia się do zmniejszenia stresu oksydacyjnego . Inne badanie kliniczne wykazało, że spożywanie diety ketogenicznej przez 20 dni znacznie zmniejszyło złogi dwutlenku węgla w organizmie, co może przynieść korzyści kliniczne u pacjentów ze zwiększonym PaCO2 z powodu niewydolności oddechowej .

pomimo popularnego stosowania pojawiają się pewne obawy dotyczące tego, jak dieta ketogeniczna wpłynie na układ całego ciała. Ponieważ dieta ketogeniczna zastępuje glukozę tłuszczem jako głównym źródłem energii, organizm jest zmuszony do aktywacji szeregu procesów metabolicznych tłuszczu w celu pozyskania energii . Procesy metaboliczne tłuszczów tworzą Acetylo-koenzym A (acetylo-CoA) jako główny produkt, który następnie wchodzi w cykl kwasu cytrynowego i jest utleniany w celu wytworzenia ATP . Acetylo-CoA, który przekracza dostępność szczawiooctanu i / lub aktywność cyklu kwasu cytrynowego, prowadzi do wzrostu liczby ciał ketonowych (acetooctan, β-hydroksymaślan i aceton). Proces ten nazywa się ketogenezą . Ciała ketonowe utworzone z diet ketogennych są kwaśne; dlatego nadmierne wydalanie tych kwasów przez nerki może powodować zmniejszenie rezerw alkalicznych lub jonów wodorowęglanowych (HCO3 -). W rezultacie wpływ diety ketogennej obniżył pH krwi, prowadząc do kwasicy ketonowej .

wykorzystano kilka modeli zwierzęcych, aby dowiedzieć się o wpływie diety wysokotłuszczowej na funkcje ważnych narządów, takich jak nerki i wątroba . Dieta wysokotłuszczowa jest bardziej prawdopodobne, aby wywołać zmniejszenie puli mitochondrialnych chinonów i jest związana ze zwiększeniem mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w wątrobie szczura . Wykazano, że dieta wysokotłuszczowa indukuje zmiany w nerkowym metabolizmie lipidów u myszy, zwłaszcza równowagę między lipogenezą a lipolizą, co prowadzi do gromadzenia się lipidów w nerkach, a w konsekwencji do zaburzeń czynności nerek .

aby uzyskać bardziej kompleksowe dane na temat tego, w jaki sposób dieta ketogeniczna może wpływać na układ całego ciała, niniejsze badanie miało na celu zbadanie wpływu długotrwałego spożywania diety ketogenicznej na profile gazowe krwi, parametry hematologiczne, funkcje narządów i poziom przeciwutleniaczy w modelu szczura.

2. Materiały i metody

2.1. Przygotowanie diety standardowej i ketogenicznej

Karma Standardowa została pozyskana od producenta jako standardowy Pellet dla gryzoni (AD2®, Indonezja), natomiast Karma ketogeniczna została przygotowana w naszym laboratorium z udziałem dietetyka. Pellety ketogeniczne zawierają 30% nietłustego tłuszczu zmieszanego z 70% tłuszczu koziego (Tabela 1), który został opracowany w oparciu o oprogramowanie NutriSurvey® w celu obliczenia spożycia kalorii oraz procentu makro i mikroelementów na gram peletu. Wszystkie składniki skroplono i zmieszano za pomocą miksera ręcznego, a następnie zamrożono na 24 godziny w temperaturze -20°C. zestalony materiał sproszkowano i formowano w granulki. Standardowe i ketogeniczne granulki zostały następnie zbadane pod kątem zawartości tłuszczu, białka i węglowodanów w Laboratorium Chemii Żywności zwierzęcej, Wydział Nauk o zwierzętach, Universitas Hasanuddin.

2.2. Protokoły doświadczalne

samce szczurów Wistar o masie ciała 200-330 g w wieku 3-4 miesięcy (n = 15) były aklimatyzowane przez 7 dni w laboratorium przed rozpoczęciem eksperymentu. Na tym etapie wszystkie szczury otrzymały standardowe granulki i wodę ad libitum. Szczury były opiekowane zgodnie ze standardem opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi, a wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki zwierząt Wydziału Lekarskiego Universitas Hasanuddin. Szczury podzielono na dwie grupy. Pierwsza grupa (n = 8) otrzymywała standardową dietę, podczas gdy druga grupa otrzymywała dietę ketogeniczną przez 60 dni. Ten 60-dniowy okres życia dorosłego szczura odpowiada ∼4 latom życia człowieka . Każdy szczur był trzymany w klatce indywidualnie i oferował 30 g pokarmu dziennie ad libitum i nie podlegał ograniczeniom kalorycznym. Pozostałe pokarmy ważono codziennie rano, aby odnotować spożycie kalorii każdego szczura. Próbki krwi pobrano po 60 dniach leczenia i przygotowano do dalszej analizy.

2.3. Analiza gazów krwi, parametrów hematologicznych, biomarkerów narządów i poziomu dysmutazy ponadtlenkowej

analizę gazów krwi przeprowadzono na pełnej krwi szczura bezpośrednio po pobraniu krwi za pomocą analizatora i-Stat® (Abbott®). Do analizy hematologicznej próbki krwi pobrano za pomocą BD® vacutainer z EDTA, odwirowano przez 20 minut z szybkością 3000 obr / min przed analizą za pomocą analizatora hematologicznego (Thermo Scientific®). Biomarkery narządów, takie jak aminotransferaza alaninowa (alat), aminotransferaza asparaginianowa (AspAT), kreatynina i mocznik, mierzono za pomocą Humalyzer 3500 (Human Global Diagnostic®) zgodnie z instrukcją na zestawach odczynników (Human®). Aby zmierzyć poziom dysmutazy ponadtlenkowej w osoczu (SOD), osocze przygotowano na podstawie instrukcji w szczurzym SOD dla zestawu ELISA (Abbexa®) i przeanalizowano za pomocą czytnika testu immunosorbentów enzymatycznych (ELISA) (Thermo Scientific®).

2.4. Analiza aktywności peroksydacji lipidów w tkankach wątroby i nerek

pod koniec eksperymentu szczury znieczulono, uśpiono i przeprowadzono laparotomię. Wątrobę i nerki szczurów usunięto i natychmiast zanurzono w ciekłym azocie. Narządy ważono 400 mg i homogenizowano przed dodaniem 2 mL roztworu buforu fosforanowego pH 7,4. Mieszaninę odwirowuje się przy 3000 obr. / min przez 20 minut. Supernatant (0,5 mL) zmieszano z 1 mL 1% kwasu tiobarbiturowego i 1 mL 1% kwasu trichlorooctowego i ogrzewano do 100°C przez 20 minut. Następnie mieszaninę odwirowywano przy 3000 obr. / min przez 10 minut, aby oddzielić pozostałość. Peroksydację lipidów narządowych mierzono jako poziom malondialdehydu (MDA) (λ = 530 nm) przy użyciu spektrofotometru UV-VIS (Agilent®).

2.5. Analiza statystyczna

Uzyskane dane analizowano za pomocą oprogramowania SPSS IBM 23. Dystrybucja danych została zbadana przy użyciu Kołmogorowa-Smirnowa w celu ustalenia, czy dane były normalnie dystrybuowane, czy nie. Dane, które były normalnie dystrybuowane, analizowano następnie przy użyciu niezależnego testu t, podczas gdy dane, które nie były normalnie dystrybuowane, analizowano przy użyciu testu U Manna–Whitneya. Uzyskano istotną różnicę if lub bardzo istotną różnicę if . Wszystkie dane przedstawiono w średniej ± SEM.

3. Wyniki

3.1. Długotrwała dieta ketogeniczna na szczurach powoduje znaczną utratę masy ciała, obniżenie poziomu glukozy we krwi i zwiększenie poziomu ketonów we krwi

skład pokarmowy peletek ketogenicznych ma znacznie mniej węglowodanów (5,66% vs 52,20%) i znacznie wyższą zawartość tłuszczu (86.19% vs 7,00%) w porównaniu do standardowej diety (Tabela 2). Kaloria standardowego chow wynosi 5.85 kCal/g, podczas gdy pellet ketogeniczny wynosi 8.29 kCal / g. średnia dzienna dawka kalorii na szczura w każdym tygodniu jest przedstawiona w tabeli 3. Stwierdzono, że standardowa grupa spożywała więcej żywności niż grupa ketogeniczna; w związku z tym spożycie kalorii w obu grupach jest dość podobne, pomimo różnicy w kaloriach na gram żywności.

stwierdzono, że różnica w składzie diety znacząco wpływa na masę ciała, poziom glukozy we krwi i ketonów we krwi u samców szczurów po 60 dniach przyjmowania. Tabela 4 pokazuje wpływ diety ketogenicznej na masę ciała szczura po 60 dniach. Podczas gdy wszystkie szczury karmione standardową dietą przybierały na wadze po 2 miesiącach (średnio około 25% wzrost w stosunku do masy wyjściowej), szczury karmione ketogenami doświadczyły utraty masy ciała o około 100 g w stosunku do początkowej masy ciała (około 40% spadek).

oprócz zmniejszenia masy ciała, poziom glukozy we krwi szczurów karmionych ketogenami był znacząco niższy w porównaniu ze standardową grupą dietetyczną (rycina 1). Na tym etapie wartość glukozy we krwi wynosiła 57 ± 5,69 mg / dl, co sugeruje stan hipoglikemiczny grupy Diet ketogenicznych. Tymczasem poziom ketonu we krwi znacznie wzrósł w grupie ketogennej, około 8 razy wyższy niż u standardowych szczurów (7,97 ± 0,15 vs 0,34 ± 0,02 mmol / l).

(a)

(b)

(a)
(b))

1

poziom glukozy we krwi i ketonów we krwi szczurów spożywających standardową i ketogeniczną dietę przez 60 dni. Symbol ∗ ∗ oznacza bardzo znaczącą różnicę () pomiędzy grupami.

3.2. Długotrwała dieta ketogeniczna znacząco obniżone pH krwi i obniżony podstawowy poziom nadmiaru

analiza wartości gazów we krwi pokazuje, że podawanie diety ketogenicznej przez 60 dni powoduje znaczącą zmianę homeostazy gazów we krwi (Tabela 5). Stwierdzono bardzo znaczące obniżenie pH krwi szczurów po 2 miesiącach stosowania diety ketogenicznej w porównaniu do tych, które żywiły się standardową dietą (). Obniżeniu pH krwi nie towarzyszyły istotne zmiany ciśnienia dwutlenku węgla (pCO2), ciśnienia tlenu (pO2), całkowitego dwutlenku węgla (TCO2) i nasycenia tlenem hemoglobiny (SO2). Chociaż poziom wodorowęglanów we krwi () w grupie ketogennej nieznacznie się zmniejszył (19,74 ± 2,54 vs 22,75 ± 0,79 mmol / l), stwierdzono, że podstawowy poziom nadmiaru w grupie był znacznie niższy w porównaniu do grupy Standardowej ().

3.3. Długotrwała dieta ketogeniczna indukuje niedokrwistość u samców szczurów

wyniki analizy hematologicznej po otrzymaniu standardowej i ketogenicznej diety przez 60 dni przedstawiono w tabeli 6. Wydaje się, że grupa ketogeniczna ma nieco niższe liczby krwinek czerwonych (RBC), znacznie niższe stężenie hemoglobiny i hematokryt, a także znacznie mniejszą średnią objętość krwinkową (MCV) i średnie wskaźniki hemoglobiny krwinkowej (MCH). Te nieprawidłowości hematologiczne wskazują, że szczury karmione dietą ketogeniczną miały anemię.

3.4. Długotrwała dieta ketogeniczna nie zmienia znacząco funkcji wątroby i nerek

W badaniu tym mierzono również wpływ długotrwałej diety ketogenicznej u szczurów na czynność wątroby i nerek. Wynik przedstawiono na rysunku 2. Z danych wynika, że poziomy biomarkerów wątrobowych, aminotransferazy alaninowej (AlAT) i aminotransferazy asparaginianowej (AspAT), nie różniły się znacząco między grupą standardową a grupą ketogenną. Jednak podczas porównywania testu czynności nerek stwierdzono nieznaczne zwiększenie stężenia kreatyniny i mocznika w osoczu w grupie ketogennej w porównaniu ze standardowym, chociaż różnica nie była statystycznie istotna.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

poziom aminotransferazy asparaginianowej (a), aminotransferazy alaninowej (b), kreatyniny w osoczu (c) i mocznika w osoczu (d) u szczurów spożywających standardową i ketogeniczną dietę przez 60 dni.

3.5. Długotrwała dieta ketogeniczna zwiększa peroksydację lipidów i zmniejsza poziom przeciwutleniaczy

poziom peroksydacji lipidów i aktywności przeciwutleniającej może być dobrym wskaźnikiem ujawnienia poziomu stresu oksydacyjnego w systemie. W badaniu tym stwierdzono, że dieta ketogenna u szczurów przez 60 dni może wywoływać wzrost poziomu malondialdehydu (MDA) w wątrobie i nerkach (ryc. 3). Wzrost poziomu MDA w obu ważnych narządach był bardzo istotny w grupie ketogennej w porównaniu do normy (). Wzrostowi poziomu MDA w grupie ketogenicznej towarzyszył obniżony poziom antyoksydacyjnej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), który był ∼80% niższy w porównaniu do poziomu standardowego ().

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

3

poziom malondialdehydu wątrobowego (a), malondialdehydu nerkowego (b) i dysmutazy ponadtlenkowej (C) w osoczu u szczurów karmionych standardowo i ketogenami. Symbol ∗ ∗ oznacza bardzo znaczącą różnicę () pomiędzy grupami.

4. Dyskusja

dieta ketogeniczna zyskała uwagę opinii publicznej, ponieważ została po raz pierwszy wprowadzona jako alternatywna terapia dla farmakopeoopornej padaczki . W dzisiejszych czasach stosowanie diety ketogenicznej rozszerzyło się poza terapię epileptyczną; rzeczywiście, jego stosowanie u zdrowych osób stało się bardziej popularne, szczególnie dla tych, którzy chcą schudnąć. Niestety, korzyści z diety ketogenicznej mogą pochodzić ze skutkami ubocznymi. W tym badaniu zbadano długoterminowe skutki diety ketogenicznej w modelu zdrowego męskiego szczura, aby uzyskać więcej informacji na temat potencjalnych powikłań tego rodzaju diety.

Standardowy pokarm z wysoką zawartością węglowodanów pozwala organizmowi wykorzystać glukozę jako główne źródło energii. Gdy spożycie węglowodanów jest więcej niż wystarczające do zaspokojenia potrzeb ATP, organizm fizjologicznie przekształci glukozę w glikogen jako zapasy energii w tkankach. Spożywanie diety bogatej w węglowodany spowoduje również wzrost ilości tłuszczu odkładającego się w tkance tłuszczowej pod skórą lub w jamie brzusznej. Jest to główny powód wzrostu masy ciała szczurów karmionych standardową dietą.

z drugiej strony, szczury leczone dietą ketogeniczną wykazywały znaczną utratę masy ciała w wyniku indukowanej ketozy. Dieta ketogeniczna o wysokiej zawartości tłuszczu, niskiej zawartości białka i niskiej zawartości węglowodanów sprawia, że organizm zależy od procesu glukoneogenezy, tworzenia się glukozy bezwodnej, do produkcji energii . Gdy kwasy tłuszczowe (zawartość tłuszczu) są wykorzystywane głównie do produkcji energii, spowoduje to tworzenie ciał ketonowych, takich jak acetooctan, beta-hydroksymaślan i aceton. Obecność ketozy w grupie ketogennej potwierdzono znamiennie wyższym poziomem ketonów we krwi (∼8 mmol/l) i znamiennie niskim poziomem cukru we krwi (<60 mg/dl). Oprócz utraty wagi szczury doświadczają również obniżenia pH lub kwasicy, która występuje w wyniku zwiększonego poziomu ketonów we krwi . Ciała ketonowe są kwaśne; tak więc wzrost liczby ciał ketonowych w krążeniu może wywołać kwasicę .

niedokrwistość nie jest rzadkim skutkiem ubocznym Diet wysokotłuszczowych. Badanie to wykazało również zmniejszenie wskaźników hematologicznych, takich jak RBC, hemoglobina, hematokryt, MCV i MCH u szczurów karmionych dietą ketogeniczną przez 60 dni. Badania na dzieciach padaczkowych wykazały, że dieta ketogenna jest bardziej narażona na niedokrwistość, która może wystąpić z powodu ograniczenia diety, co prowadzi do niedoboru miedzi . Jednak to powikłanie diety ketogenicznej można opanować suplementacją miedzi.

w tym badaniu podawanie diety ketogennej szczurom przez 60 dni nie wpływało znacząco na czynność wątroby i nerek. Niemniej jednak stężenie kreatyniny i mocznika w osoczu szczurów karmionych ketogenami było nieco wyższe niż u szczurów karmionych standardowo, co może sugerować niewielki wpływ diety ketogennej na czynność nerek. Efekt ten może być bardziej uderzający, jeśli czas podawania diety ketogenicznej jest dłuższy.

interesujące jest to, że chociaż czynność wątroby i nerek nie zostały znacząco zmienione, aktywność peroksydacji lipidów w obu narządach znacznie wzrosła. Wskazuje na to istotnie wyższy poziom MDA w wątrobie i tkankach nerek u szczurów karmionych ketogenami w porównaniu ze standardową dietą. Zwiększona aktywność peroksydacji lipidów może być wywołana zwiększeniem reaktywnych form tlenu (ROS) w narządach i niezdolnością aktywności enzymu przeciwutleniającego do ochrony błon komórkowych przed uszkodzeniem wywołanym przez ROS. Wynik ten może stanowić potencjalne zagrożenie dla obu narządów, jeśli dieta będzie utrzymywana dłużej niż badany okres. Zgodnie z tym stężenie dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w osoczu znacznie się zmniejszyło u zwierząt karmionych ketogenami (), co sugeruje obecność stresu oksydacyjnego wywołanego długotrwałą dietą ketogeniczną u szczurów.

powód, dla którego dieta ketogenna może wywoływać stres oksydacyjny, został wyjaśniony w kilku badaniach. Wiadomo, że ciała ketonowe stymulują mitochondria do produkcji większej ilości ATP w porównaniu z glukozą . Jednak metabolizm tłuszczów wymaga bardziej złożonych procesów, takich jak redukcja, utlenianie, hydroksylacja i koniugacja, które mogą zwiększyć produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach wątroby . Jeśli uwalnianie ROS jest w równowadze z aktywnością antyoksydacyjną organizmu, można zapobiec wystąpieniu stresu oksydacyjnego. W przeciwieństwie do tego, jeśli tworzenie ROS przekroczyło poziom przeciwutleniaczy, wolne rodniki zaatakują makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, DNA i błony komórkowe, które zawierają wielonienasycone kwasy tłuszczowe, prowadząc do uszkodzenia komórek . Badanie to pokazuje wzrost poziomu MDA w wątrobie i nerkach, któremu towarzyszy spadek SOD w osoczu po 60-dniowym spożyciu diety ketogenicznej. Może to sugerować środki ostrożności przy długotrwałym stosowaniu diety ketogenicznej.

5. Wnioski

pomimo utraty wagi, niskiego poziomu cukru we krwi i wysokiego poziomu ketonów we krwi, zrównoważone spożywanie diety ketonowej przez 60 dni u szczurów również wywołało pewne skutki, takie jak kwasica metaboliczna, niedokrwistość i zmniejszenie poziomu enzymów antyoksydacyjnych w osoczu. Interesujące jest to, że chociaż znaczny wzrost aktywności peroksydacji lipidów w wątrobie i nerkach, obie funkcje narządów pozostały nienaruszone, przynajmniej w badanym okresie.

Dostępność Danych