stosując technikę DBE systematycznie zbieraliśmy biopsje z całego przewodu pokarmowego człowieka i scharakteryzowaliśmy rozmieszczenie enteroendokrynnych komórek K i L oraz ekspresję ich produktów hormonalnych u osób zdrowych i chorych na cukrzycę typu 2.
ponieważ cukrzyca typu 2 implikuje nadwagę / otyłość i dysfunkcyjną homeostazę glukozy, która może korelować ze zmianami w komórkach K i L enteroendokryny, badanie zostało zaprojektowane w celu opisania wzorca dystrybucji tych komórek i ekspresji niektórych ich produktów w dwóch prospektywnie rekrutowanych, podobnie dużych, dobrze zdefiniowanych i dopasowanych grupach ochotników bez żadnych znanych zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Za pomocą DBE można było uzyskać dużą liczbę próbek w całym przewodzie pokarmowym: z dziewięciu anatomicznie specyficznych regionów (rys. 1) i 7-22 „stacje” wzdłuż jelita czczego i jelita krętego. Biopsje z dobrze zdefiniowanych anatomicznie obszarów były bardzo porównywalne. Istnieje większa niepewność co do lokalizacji biopsji w jelicie czczym i bliższym jelicie krętym (lokalizacje biopsji 3-9, Fig. 1) ze względu na zmienną długość intubacji, a co za tym idzie liczbę próbek pobranych między osobnikami. Aby poradzić sobie z tym problemem, systematycznie podzieliliśmy jelito czcze i jelito kręte na siedem regionów (patrz metody). Znak atramentu podśluzówkowego umieszczony na maksymalnej głębokości wprowadzenia podczas enteroskopii przednio-brzusznej zaobserwowano podczas enteroskopii wstecznej u czterech z 24 osób, co wskazuje na całkowitą enteroskopię (Fig. 2). Zakłada się, że większość przewodu pokarmowego była badana u reszty uczestników oceniana na podstawie długości wykonanej intubacji (szczegóły w naszym artykule metodycznym ).
użyliśmy immunohistochemii i liczby komórek do ilościowego określenia komórek enteroendokrynnych i enzymów przetwarzających prohormony oraz analizy ekspresji mRNA qPCR do oceny produktów hormonalnych/enzymatycznych. Obie metody są dobrze ugruntowane, ale również stwarzają ograniczenia. Wysoka swoistość przeciwciał stosowanych w immunohistochemii ma duże znaczenie dla zapewnienia minimum niespecyficznego barwienia (fałszywie dodatnie). W związku z tym wybraliśmy przeciwciała, które są dobrze ugruntowane i dobrze scharakteryzowane . Wykorzystując immunohistochemię i liczbę komórek z mikrofotografii wycinanych biopsji, trójwymiarowe obiekty (tj. komórki enteroendokrynne) są oceniane za pomocą techniki obrazowania dwuwymiarowego. Bardziej optymalną techniką oceny rozkładu komórek byłaby stereologia, w której szacowana jest rzeczywista gęstość (tj. komórki / tkanka mm3). Jednak technika ta wymagałaby kompletnych poprzecznych „bloków” tkanki, co jest niezgodne z dużą liczbą miejsc biopsji, a tym samym szczegółowego mapowania przewodu pokarmowego u żywych ludzi, do czego zmierzono w niniejszym badaniu. Ponadto należy wziąć pod uwagę, co następuje. Po pierwsze, ocena ekspresji mRNA wskazuje na aktywność komórek endokrynologicznych, ale nie zapewnia miary całkowitej produkcji określonego produktu komórkowego, ponieważ nie wszystkie mRNA są przekształcane w końcowy produkt aktywny. Po drugie, ekspresja jest względna, ponieważ specyficzne transkrypty mRNA są związane z ekspresją stabilnie wyrażonego genu (patrz metody ESM dla dalszych szczegółów). Biorąc pod uwagę biologiczną heterogeniczność cukrzycy typu 2, bardziej wyraźne różnice mogły potencjalnie zostać wykryte przy większej wielkości próby i włączeniu pacjentów z bardziej rozległą dysregulacją glukozy.
praca Sjölunda i wsp .z 1983 r. na temat dystrybucji komórek enteroendokrynnych jest do tej pory najbardziej szczegółowo przeprowadzona w jelicie ludzkim przy użyciu IHS z szeroką gamą antysurowic (25 typów) przeciwko znanym lub proponowanym peptydom neurohormonalnym w jelitach. Techniki małoinwazyjne nie były wówczas dostępne. W związku z tym pobrano próbki tylko z siedmiu regionów: proksymalnego i dystalnego dwunastnicy, środkowego jelita czczego, dystalnego jelita krętego, wstępującego okrężnicy, dystalnej części poprzecznego okrężnicy lub esicy okrężnicy i odbytnicy. Dla każdego regionu materiał tkankowy uzyskano od 9-17 osobników. Próbki pobierano podczas operacji jamy brzusznej (głównie z powodu nowotworu złośliwego) lub podczas badań enteroskopowych obejmujących biopsje u osób z „innymi zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi”, w tym różnymi nieokreślonymi objawami i chorobami (np. „krwawieniem utajonym” i „chorobą wątroby”). W 1985 Adrian i wsp. zastosowali technikę testu radioimmunologicznego do określenia ilości PYY w dnie żołądka i antrum, dwunastnicy, jelicie czczym, jelicie krętym, wstępującym okrężnicy, esicy i odbytnicy . Próbki z każdej lokalizacji pobrano od 5-8 osób poddanych zabiegom chirurgicznym z powodu raka lub wrzodów żołądka. W 1992 r. eissele i wsp. opisali badanie dotyczące dystrybucji enteroendokrynnych komórek L u ludzi . Próbki Pobrano z siedmiu regionów: dwunastnicy, bliższego i dalszego jelita czczego, jelita krętego, okrężnicy wstępującej, okrężnicy poprzecznej i odbytnicy. Próbki uzyskano od zaledwie pięciu uczestników, którzy przeszli operację raka lub choroby Crohna. W 2005 r. Guedes i wsp. badali rozmieszczenie komórek GIP -, GLP – 1-i CGA-dodatnich, stosując IHS na próbkach z każdego 20 cm jelita cienkiego w 30 ludzkich zwłokach .
należy podkreślić, że w czterech wyżej wymienionych badaniach badano normalnie pojawiające się próbki tkanek bez oznak zmian patologicznych. Jednak obecność złośliwych lub zapalnych zmian w obszarze jelitowym lub szybkie rozpoczęcie degradacji komórek po śmierci może mieć wpływ na ogólną dystrybucję i funkcjonowanie komórek enteroendokrynnych. Ponadto heterogeniczność uczestników mogła mieć wpływ na wyniki.
w zgodzie z naszymi Wynikami, Sjölund i wsp., Eissele i wsp., Adrian i wsp. oraz Guedes i wsp., opisali różnice w produktach komórek L (GLP-1 i/lub PYY) w zależności od lokalizacji jelit, z większą gęstością/ilością w dystalnym jelicie czczym i jelicie krętym w porównaniu z dwunastnicą i proksymalnym jelitem jelitowym oraz zwiększającą się gęstością/ilością od proksymalnego do dystalnego jelita grubego, z najwyższymi poziomami w odbytnicy. Nasze wyniki wspierają ten wzór dystrybucji komórek L u zdrowych osób i w cukrzycy typu 2, ze zwiększeniem ekspresji genu GCG i PYY, a także zwiększeniem gęstości komórek GLP-1 i PYY-dodatnich, wzdłuż jelita cienkiego i wzdłuż jelita grubego. Zaobserwowano również największy sygnał markerów komórek L (komórki PYY – i GLP-1-Dodatnie oraz ekspresję mRNA PYY) w odbytnicy, z wyjątkiem ekspresji GCG. Konsekwencje—jeśli w ogóle-zaobserwowanych różnic między grupami (znacznie większa ekspresja GCG i PYY w okrężnicy uczestników z cukrzycą typu 2 w porównaniu z osobami zdrowymi) są obecnie nieznane. Ustalono, że efekt inkretyny zmniejsza się w cukrzycy typu 2 i zaproponowano, że defekt wydzielania GLP-1 wywołanego przez składniki odżywcze może przyczynić się do wyjaśnienia tego zjawiska. Jednak badania badające reakcje GLP-1 na bodźce odżywcze u osób z cukrzycą typu 2 i osób bez cukrzycy wykazały, że generalnie osoby z cukrzycą typu 2 nie wykazują zmniejszonej całkowitej odpowiedzi GLP-1 w osoczu .
zaobserwowaliśmy rozbieżność między poziomami ekspresji GCG a gęstością komórek GLP-1-dodatnich wzdłuż jelita. Podkreśla to, że komórki L w jednej części jelita cienkiego mogą zachowywać się inaczej niż enteroendokrynne komórki L w innej części jelita cienkiego, jak sugerują Svendsen i wsp., którzy zaobserwowali, że wzór wydzielania komórek l zmienia się wzdłuż przewodu pokarmowego u szczurów, tzn. komórki l wydzielają różne proporcje PYY i GLP-1, a niektóre wydzielają tylko GLP-1. Zgodnie z tymi ustaleniami, jest prawdopodobne, że bardziej dystalnie zlokalizowane komórki l wyrażają proglukagon w większym stopniu niż bardziej proksymalnie zlokalizowane komórki L.
nasze ustalenia dotyczące większej ekspresji GIP i gęstości komórek GIP-dodatnich w proksymalnej części jelita cienkiego, zarówno zmniejszających się dystalnie do okolicy krtaniowo-szyjnej u zdrowych osób, jak i osób z cukrzycą typu 2, są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami . W przeciwieństwie do Sjölunda i wsp., który stwierdził, że komórki GIP-dodatnie nie występują w jelicie grubym, byliśmy w stanie wykryć niski poziom komórek GIP-dodatnich w dalszej części przewodu pokarmowego. Nie możemy jednak wykluczyć, że jest to wynik niespecyficznego wiązania przeciwciała. Zaobserwowaliśmy jednak ekspresję mRNA GIP w okrężnicy obu grup, choć na bardzo niskim poziomie. Ekspresja GIP była znacznie większa u osób z cukrzycą typu 2 wzdłuż całego przewodu pokarmowego. Można spekulować, że transkrypcja GIP jest zwiększona w wyniku kompensacji oporności GIP, tj. zmniejszonego działania insulinotropowego GIP obserwowanego u osób z cukrzycą typu 2 . W związku z tym wykazano, że poziomy GIP na czczo są wyższe u uczestników z cukrzycą typu 2 w porównaniu z osobami kontrolnymi bez cukrzycy, a ponadto zaproponowano, że GIP przyczynia się do hiperglikemii obserwowanej w cukrzycy typu 2 (głównie ze względu na działanie glukagonotropowe GIP) . Jednak dane dotyczące odpowiedzi GIP po podaniu doustnym glukozy lub mieszanych posiłków u osób z cukrzycą typu 2 były niespójne, a systematyczny przegląd z metaanalizą sugerował, że odpowiedzi GIP po posiłku są podobne u osób z cukrzycą typu 2 i u osób zdrowych .
biorąc pod uwagę, że kwaśna glikoproteina CGA jest składnikiem pęcherzyków komórkowych i uważana za odgrywającą wiele ról w procesie wydzielniczym produktów endokrynologicznych, jest stosowana jako ogólny marker komórek enteroendokrynnych . W przeciwieństwie do Guedesa i wsp., którzy obserwowali stałą gęstość komórek CGA-dodatnich wzdłuż jelita cienkiego, nasze badanie wykazało znaczny spadek. Ponadto zaobserwowaliśmy większą gęstość komórek CGA-dodatnich w jelicie cienkim u zdrowych osób niż u osób z cukrzycą typu 2. Można spekulować, że całkowita liczba komórek CGA-dodatnich (komórek enteroendokrynnych) zmienia się w cukrzycy typu 2—albo w wyniku stanu cukrzycy typu 2, albo, być może, przyczyniając się do patogenezy cukrzycy typu 2. Zaobserwowaliśmy dość dużą liczbę komórek CGA-dodatnich w odbytnicy obu grup. Ostatnio Engelstoft i wsp. wykazali u myszy , że CgA jest głównie zlokalizowane w komórkach enteroendokrynnych wydzielających monoaminę i rzadziej w komórkach enteroendokrynnych wydzielających peptydy, być może popierając propozycję Sjölunda i wsp., że odbytnicze komórki enteroendokrynne mogą mieć głównie funkcję lokalną (parakrynną), a nie układową.
ponieważ wiadomo, że PC1/3 przetwarza prohormony prowadzące do powstania GIP i GLP-1, spodziewaliśmy się znaleźć obecność PC1 / 3 wzdłuż całego przewodu pokarmowego. Zaobserwowaliśmy odpowiednio rozbieżność polegającą na większej ekspresji PCSK1 / 3 i mniejszej gęstości komórek PC1 / 3-dodatnich w jelicie cienkim uczestników z cukrzycą typu 2 w porównaniu ze zdrowymi uczestnikami. Jak przedstawiono powyżej, to odkrycie należy interpretować z poglądem, że niektóre komórki enteroendokrynne mogą być bardzo aktywne w niektórych regionach, a mają niską aktywność w innych regionach.
ponieważ PC2 jest znany głównie z przetwarzania proglukagonu na glukagon w komórkach Alfa trzustki, interesujące było znalezienie ekspresji mRNA komórek pcsk2 i PC2-dodatnich wzdłuż całego przewodu pokarmowego. Może to wskazywać, że glukagon jest wytwarzany w jelitach, jak ostatnio zasugerowali Lund et al. Zgodnie z tym można spekulować, że większa ekspresja PCSK2 w jelicie cienkim u osób z cukrzycą typu 2 prowadzi do powstawania nadmiaru glukagonu, przyczyniając się do hiperglikagonemii cukrzycowej typu 2. W celu dalszego wyjaśnienia tego aspektu uzasadnione są badania obejmujące immunohistochemiczne podwójne barwienie.
podsumowując, obecne mapowanie rozkładu enteroendokrynnych komórek K I L oraz zaobserwowane różnice w poziomach ekspresji powiązanych z nimi produktów wzdłuż przewodu pokarmowego człowieka, w połączeniu z wykazanymi różnicami między uczestnikami z cukrzycą typu 2 a osobami zdrowymi, stanowią pracę referencyjną dla naukowców i klinicystów. W połączeniu z wiedzą z badań fizjologicznych dotyczących krążących hormonów jelitowych, nasze dane mogą być przydatne w zrozumieniu, w jaki sposób jelita przyczyniają się do regulowania metabolizmu glukozy i apetytu. Identyfikacja PC2 w komórkach enteroendokrynnych jest interesująca, ponieważ może to być zgodne z tworzeniem glukagonu w jelitach człowieka. Konieczne są jednak dalsze badania, aby udowodnić tę możliwość i powiązać nasze wyniki z patofizjologią cukrzycy typu 2.
