Geny Knocking-down i Knocking-out

geny Knocking-down
ta technika pozwala na zmniejszenie ekspresji jednego lub więcej anorganism. Może to nastąpić poprzez modyfikację genetyczną lub leczenie za pomocą oligonukleotydu krótkiego DNA lub RNA, który ma sekwencję uzupełniającą albo Gen, albo transkrypcję mRNA.
jeśli zmiana ekspresji genu jest spowodowana przez oligonukleotyd wiążący się z mRNA lub czasowo wiążący się z genem, prowadzi to do tymczasowej zmiany ekspresji genu,która nie modyfikuje chromosomalnego DNA, a wynik jest określany jako „przemijające knockdown”.
w przemijającym knockdown Wiązanie tego oligonukleotydu z aktywegenem lub jego transkryptami powoduje zmniejszenie ekspresji. Wiązanie może nastąpić poprzez blokowanie transkrypcji, degradację transkrypcji mRNA (np. siRNA lub antysensowność zależna od RNazy-H), lub poprzez blokowanie translacji mRNA, miejsc splicingu pre-mRNA lub rozszczepiania nukleaz stosowanych do dojrzewania innych funkcjonalnych RNA, w tym miRNA (e.g.by morpholino oligos).
najbardziej bezpośrednie użycie przemijających knockdown jest do poznania genu, który został zsekwencjonowany, ale ma nieznaną funkcję. To eksperymentalne podejście jest znane jako genetyka odwrotna. W biologii rozwojowej często stosuje się przemijające knockdown, ponieważ oligos może być wstrzykiwany do jednokomórkowych zygot i będzie obecny w komórkach potomnych wstrzykniętej komórki.

interferencja RNA (RNAi)jest środkiem wyciszania genów poprzez degradację mRNA. Gen knockdownby metoda ta jest osiągana przez wprowadzenie małych dwuniciowych interferingrna (siRNA) do cytoplazmy. Po wprowadzeniu do komórki egzogenoussirna są przetwarzane przez RISC. SiRNA jest uzupełnieniem targetmRNA, który ma być wyciszony, a RISC używa siRNA jako szablonu do lokalizacji mRNA. Po zlokalizowaniu RISC do docelowego mRNA RNA jest rozszczepiany przez rybonukleazę.
RNAi jest używany do genetycznej analizy funkcjonalnej. Zastosowanie RNAi może być przydatne w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych, rozwoju leków lub innych zastosowań.

Geneknockout
Geneknockout (KO) to technika genetyczna, w której jeden z genów organizmu jest nieaktywny. Organizmy Knockout są wykorzystywane do badania funkcji genów, Zwykle badając efekt utraty genów. Heterozygotyczny i homozygotyczny Kos: w pierwszym z nich znokautowany jest tylko jeden allel, w drugim oba allele są znokautowane.

ukierunkowane tworzenie KO rozpoczyna się w probówce z plazmidem, sztucznym chromosomem bakteryjnym lub innym konstruktem DNA, a następnie przechodzi do hodowli komórkowej. Komórki są transfekowane DNAconstruct. Często celem jest stworzenie transgenicznego zwierzęcia, które ma zmieniony gen.
jeśli tak, embrionalne komórki macierzyste są genetycznie przekształcane i wkładane do wczesnych zarodków. Powstałe zwierzęta ze zmianą genetyczną w komórkach linii zarodkowej mogą następnie często przekazywać knockout genu do przyszłych pokoleń.

konstrukcja jest skonstruowana tak, aby rekombinować z docelowym genem, co odbywa się poprzez inkorporowanie sekwencji z samego genu do konstrukcji.Rekombinacja następuje następnie w regionie tej sekwencji w obrębie genu, co skutkuje wstawieniem sekwencji obcej w celu zakłócenia genu.
warunkowy nokaut umożliwia delecję genu w tkance lub w określonym czasie. Odbywa się to poprzez wprowadzenie miejsc loxP wokół genu. Te następstwa zostaną wprowadzone do linii zarodkowej za pomocą tego samego mechanizmu, co aknock-out. Ta linia zarodkowa może być następnie przekroczona do innej rekombinazy zawierającej zarodek, która jest enzymem wirusowym, który może rozpoznawać te sekwencje, rekombinować je i usuwać Gen flankowany przez te miejsca.
ponieważ rekombinacja dna jest rzadkim zdarzeniem, Sekwencja obca wybrana do insercji zwykle obejmuje reportera. Umożliwia to łatwy dobór komórek lub osób, w których nokaut był udany. Czasami DNAconstruct wstawia się do chromosomu bez pożądanej homologiizłączenie z genem docelowym.

(Ivana Venezia)

jest to technika, dzięki której ekspresja genu jest zmniejszona. Redukcja ta może wynikać z modyfikacji DNA lub wiązania oligonukleotydu z mRNA lub z genem. W tym przypadku zmiana wyrażenia jest tymczasowa, więc wetalk o transient knockdown.
jedna z technik pozwalających na przemijające znokautowanie genu polega na zastosowaniu oligomerów Morfolino. Stały się one standardowym narzędziem knockdown w zwierzęcych układach embrionalnych, więc Morfolinooligo są często używane do badania roli specyficznego transkryptu mRNA w embrionie. Jego struktura molekularna ma zasady DNA przyłączone do szkieletu pierścieni metylenomorfolinowych połączonych przez grupy fosforodiamidowe. Morfolinos blokuje dostęp othermolecules do małych (~25 zasad) specyficznych sekwencji zasadowych parujących powierzchni kwasu rybonukleinowego (RNA). Ze względu na ich całkowicie nienaturalne kości wsteczne, Morfolinos nie są rozpoznawane przez białka komórkowe. Nukleazy nie degradują Morfolinos, nie ulegają rozkładowi w surowicy ani w komórkach. Nie są opublikowane doniesienia o Morfolinosach aktywujących receptory tollopodobne lub wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, takiej jak indukcja interferonu lub odpowiedź zapalna zależna od NF-kB.Morfolinos nie modyfikuje metylacji DNA.
Morfolinos nie wyzwalają degradacji ich docelowych cząsteczek RNA, w przeciwieństwie do wielu antysensownych typów strukturalnych (np. fosforotioinianów, siRNA). Zamiast tego Morfolinozakłada się poprzez „blokowanie steryczne”, Wiązanie się z sekwencją docelową w RNA, hamując cząsteczki, które w przeciwnym razie mogłyby wchodzić w interakcje z RNA.
Morfolinos może również modyfikować splatanie pre-mRNA lub hamować ich naturę i aktywność miRNA.
blokując translację
związaną z 5′-nieprzetłumaczonym regionem Posłańca RNA (mRNA), Morfolinos może zakłócać postęp rybosomalnego kompleksu inicjacyjnego z 5′ czapki do startmodon. Zapobiega to translacji regionu kodującego transkryptu docelowego (zwanego „knocking down”geneexpression). Jest to przydatne doświadczalnie, gdy badacz chce poznać funkcję określonego białka; Morfolinos zapewniają dogodne środki do niszczenia ekspresji białka i uczenia się, jak niszczenie zmienia komórki lub organizm.
modyfikowanie splicingu pre-mRNA
Morfolinoskan ingeruje w etapy przetwarzania pre-mRNA albo przez zapobieganie kierowaniu małymi jądrowymi kompleksami rybonukleoprotein (snRNP) przed wiązaniem się z ich celami na granicach intronów na nici pre-mRNA, albo przez blokowanie nukleofilowej Zasady adeninowej i zapobieganie jej formowaniu struktury splicingu, albo przez zakłócanie wiązania białek regulujących splice, takich jak tłumiki splicingu i splice wzmacniacze. Zapobieganie wiązaniu snRNP U1 (w miejscu dawcy) lub U2/U5 (w miejscu grupy polipirymidynowej i akceptora) może powodować zmodyfikowane splicing, Zwykle wykluczając eksony z dojrzałego mRNA. Ukierunkowanie na niektóre cele splicingu skutkuje inkluzjami intronowymi, podczas gdy aktywacja tajemniczych miejsc splicingu może prowadzić do częściowych inkluzji lub wykluczeń.Cele Snrnps U11 / U12 mogą być również blokowane. Modyfikacja splicingu może być korzystnie oznaczana przez odwrotną transkryptazową reakcję łańcuchową polimerazy (RT-PCR) i jest postrzegana jako przesunięcie pasma po elektroforezie żelowej produktów RT-PCR.
nokaut
odmianą tradycyjnego nokautu genu jest warunkowy nokaut genu.
warunkowy nokaut genu jest techniką stosowaną w celu wyeliminowania specyficznego genu w pewnej tkance, takiej jak wątroba. Technika ta jest przydatna do badania roli poszczególnych genów w organizmach żywych. Różni się od tradycyjnego knockoutu genu, ponieważ celuje w określone geny w określonym czasie, a nie jest usuwany od początku życia. Korzystanie z warunkowej techniki geneknockout eliminuje wiele skutków ubocznych tradycyjnego nokautu genu. W tradycyjnym knockout genu może dojść do śmierci embrionalnej z powodu mutacji genu, co uniemożliwia naukowcom badanie tego genu. Niektóre tkanki nie mogą być właściwie badane w izolacji, więc Gen musi być nieaktywny w określonej tkance, pozostając aktywnym w innych. Dzięki tej technologii naukowcy są w stanie nokautować geny na określonym etapie rozwoju i badać, w jaki sposób nokaut genu w jednej tkance wpływa na ten samegen w innych tkankach.
najczęściej stosowaną techniką jest system Cre-loxrecombination. Enzym rekombinazy Cre specyficznie rozpoznaje dwa miejsca (loci rekombinacji) w DNA i powoduje rekombinację między nimi. Ta rekombinacja spowoduje delecję lub inwersję genów między dwoma miejscami lox, w zależności od ich orientacji. Gen Anentire może być usunięty lub inaktywowany. Cały ten system jest indukowalny, więc można go dodać, aby wybić geny w określonym czasie. Dwa z najczęściej stosowanych związków chemicznych to tetracyklina, która aktywuje transkrypcję genu rekombinazy i tamoksyfen, który aktywuje transport białka Crerekombinazy do jądra. Tylko kilka typów komórek wyraża Crerekombinazę, a żadne komórki ssaków nie wyrażają jej, więc nie ma ryzyka przypadkowej aktywacji miejsc lox podczas stosowania warunkowego knockoutu genu u ssaków.
mysz zawierająca Gen Cre i mysz zawierająca sekwencje loxP są hodowane w celu wygenerowania warunkowego nokautu dla konkretnego zainteresowania. Myszy nie wykazują naturalnej ekspresji rekombinazy kreatynowej ani loxsites, ale zostały zaprojektowane do ekspresji tych produktów genowych w celu stworzenia pożądanego potomstwa. Musisz otrzymać mysz, U której ważny ekson jest flokowany (to znaczy, że ma aLox-P w górę i w dół) i mysz, która ma sekwencję Cre, której ekspresja jest regulowana przez promotor specyficzny dla typu komórki lub promotor indukowalny. Następnie krzyżujemy te myszy i otrzymujemy mysz, U której komórki nieekspresujące Cre będą miały gen z normalną funkcją, podczas gdy komórki wyrażające Cre będą miały funkcję genu zaburzoną w części między Lox-P.
(Francesca Luca)

mechanizm interferencji RNA

interferencja RNA (RNAi), anancient cellular antiviral response, jest naturalnym mechanizmem wyciszania ekspresji genu. Można go wykorzystać w celu umożliwienia swoistego zahamowania funkcji genu anytarget. RNAi okazuje się nieocenionym narzędziem badawczym, pomaga w identyfikacji nowych genów zaangażowanych w procesy chorobowe.

RNAi nie jest jedynym mechanizmem ekspresji genów (tabela 1).

Tabela 1: Porównanie różnych metod wyciszania genów.

interferencja RNA(RNAi) występuje w odpowiedzi na wprowadzenie dwuniciowego RNA (dsRNA)do komórki. Wprowadzenie dsRna wyzwala aktywację zależnej od RNA kinazy białkowej-R (PKR). Aktywowany PKR fosforyluje czynnik inicjujący translację EIF2: efekt ten, w połączeniu z aktywacją RNazy-L i indukcją produkcji interferonu, zatrzymuje syntezę białek i sprzyja apoptozie. Ogólnie uważa się, że stanowi to mechanizm przeciwwirusowy. RNAi jest wysoce zachowanym mechanizmem w obrębie gatunków taksonomicznych . Oprócz działania przeciwwirusowego uważa się, że RNAi hamuje ekspresję potencjalnie szkodliwych segmentów genomu, takich jak transpozony, które mogą destabilizować Genom poprzez działanie jako insercyjne mutageny.

chociaż jego mechanizmy nie są w pełni wyjaśnione, RNAi reprezentuje wynik procesu wieloetapowego (Rysunek 1). Po wejściu do komórki długie dsRNA są najpierw przetwarzane przez Dicer enzymatyczny RNazy III. Ten funkcjonalny dimer zawiera selikazę, Wiązanie dsRNA i domeny PAZ (ich role nie są całkowicie wyjaśnione). Dicer wytwarza 21-23 nukleotydowe fragmenty dsRNA z dwoma końcowymi nawisami 3′ nukleotydu, czyli sirna. RNAi jest pośredniczony przez RNA-inductedsilencing complex (RISC), który, kierowany przez siRNA, rozpoznaje mRNA zawierające sekwencję homologiczną do siRNA i rozszczepia mRNA w miejscu zlokalizowanym mniej więcej w środku regionu homologicznego. Tak więc ekspresja genów jest specyficznie inaktywowana na poziomie po transkrypcji.

W C. elegans, Dicer wykazano, aby wchodzić w interakcje z białkami rde. Białka rde wiążą się z długim dsRNA i są w stanie przedstawić długi dsRNA do Dicer w celu przetworzenia. Mutanty wykazujące wysoki stopień oporności na RNAi miały mutacje loci atrde-1 i RDE-4.

Rysunek 1: Mechanizm RNAi

pojawienie się podwójnego RNA (DS) w komórce (np. w wyniku infekcji wirusowej)wyzwala złożoną odpowiedź, która obejmuje między innymi zjawiska (np.wytwarzanie interferonu i jego konsekwencje) kaskada zdarzeń molekularnych znanaz RNAi. Podczas RNAi enzym komórkowy Dicer wiąże się z dsRNA i rozszczepia na krótkie kawałki o długości ~ 20 par nukleotydów, znane jako małe interferujące RNA (siRNA). Te pary RNA wiążą się z enzymem komórkowym zwanym kompleksem wyciszania indukowanego przez drna (RISC), który wykorzystuje jedną nić siRNA do wiązania jednoniciowych cząsteczek RNA (tj. mRNA) o komplementarnej sekwencji. Następnie aktywność nukleazy RISC degraduje mRNA, wyciszając w ten sposób ekspresję genu wirusowego. Podobnie uważa się, że genetyczna maszyna komórek toutilize RNAi do kontrolowania ekspresji endogennego mRNA, dodając w ten sposób nową warstwę regulacji po transcypcyjnej. RNAi może być wykorzystywany w warunkach eksperymentalnych, aby znokautować docelowe geny interesujące za pomocą wysoce specyficznej i stosunkowo łatwej technologii (więcej szczegółów w tekście).

oprócz genesilencing, RNAi może być zaangażowany w inne zjawiska regulacji genów.. Wydaje się, że RNAi może również funkcjonować poprzez metylowanie cytozyn, a także sekwencje CPG bardziej klasycznie związane z metylacją. Jeśli sekwencja docelowa jest homologiczna z promotorem, może wystąpić wyciszenie transkrypcyjne. Co więcej, RNA wydaje się oddziaływać z domenami chromatyny, które ostatecznie mogą kierować metylacją DNA. Badania C. elegans wykazały, że RNAi może rozprzestrzeniać się między komórkami poprzez mechanizmy, które mogą nie zależeć od siRNA.Układowy locus z niedoborem interferencji RNA (sid), sid-1, koduje zachowaną proteinę sekwencją peptydu sygnałowego i 11 domen transbłonowych,sugerując, że białko sid-1 może działać jako kanał dla długiego dsRNA,siRNA lub obecnie nieodkrytego sygnału związanego z RNAi. Mutanty Sid-1 zachowują autonomiczne RNAi, ale nie wykazują rozprzestrzeniania się RNAi. Pozostaje nieczytelne, czy ten systemowy RNAi występuje u ssaków, chociaż istnieje silne podobieństwo między sid – 1 A przewidywanymi białkami ludzkimi i mysimi.

(Justine Floret)

źródło : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang= „en-gb” xml:lang= „en-gb”>

ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

te trzy technologie molekularne pozwalają na edytowanie genomu w sposób specyficzny dla danego miejsca, każda technika ma inny mechanizm. Zinc-finger nucleases (Zfns) i transcription activator-like effector nucleases (TALENs) są chimeric nucleases composed of programmable, sequence-specific DNA-binding modules linked to a non-specific DNA cleavage domain. Zfns i TALENs umożliwiają szeroką gamę genetycznych modyfikacji przez indukowanie DNA dwuniciowych przerw, które stymulują podatne na błędy nie-homologiczne łączenie końca lub homologiczne ukierunkowaną naprawę w określonych lokalizacjach genomowych.

obraz pochodzi z http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

wszechstronność Zfns i TALENs wynika z możliwości dostosowania domeny wiążącej DNA do rozpoznawania praktycznie każdej sekwencji. Te moduły wiążące DNA mogą być łączone z wieloma domenami efektorowymi, aby wpływać na strukturę i funkcję genomu, włączając nukleazy, aktywatory transkrypcyjne i represory, rekombinazy, transpozazy, metylotransferazy histonów DNA i acetylotransferazy histonów. Tak więc zdolność do skutecznego wykonywania zmian genetycznych zależy w dużej mierze od specyficzności wiążącej DNA i powinowactwa zaprojektowanych białek palca cynkowego i TALE.

białka palca cynkowego Cys2-His2

domena palca cynkowego Cys2-His2 jest jednym z najczęstszych typów motywów wiążących DNA występujących u eukariotów i stanowi drugą najczęściej kodowaną domenę białkową w ludzkim genomie. Pojedynczy palec cynkowy składa się z około 30 aminokwasów w zachowanej konfiguracji ββα. Kilka aminokwasów na powierzchni α-helisy zazwyczaj styka się z trzema parami zasad w głównym rowku DNA, o różnym poziomie selektywności. Modułowa struktura białek palców cynkowych uczyniła z nich atrakcyjne ramy do projektowania niestandardowych białek wiążących DNA. Kluczem do zastosowania białek palców cynkowych do specyficznego rozpoznawania DNA było opracowanie nienaturalnych tablic zawierających więcej niż trzy domeny palców cynkowych. Ten postęp był ułatwiony przez oparte na strukturze odkrycie wysoce konserwowanej sekwencji łącznika, która umożliwiła budowę syntetycznych białek palców cynkowych, które rozpoznały sekwencje DNA o długości od 9 do 18 bps. Ponieważ 18 bps sekwencji DNA może nadawać swoistość w obrębie 68 miliardów bp DNA, ta metoda pozwoliła na ukierunkowanie specyficznych sekwencji w ludzkim genomie po raz pierwszy.

efektory podobne do aktywatorów transkrypcji

TALEs są naturalnie występującymi białkami z chorobotwórczych bakterii z rodzaju Xanthomonas i zawierają domeny wiążące DNA złożone z serii 33-35 powtórzeń aminokwasów, z których każda rozpoznaje pojedyncze bp. Specyficzność TALE ’ A jest określana przez dwa nadmienne aminokwasy, które są znane jako diresidues o zmiennej wielokrotności (rvds) . Podobnie jak palce cynkowe, modularne powtórki opowieści są połączone ze sobą w celu rozpoznania ciągłych sekwencji DNA. Jednak w przeciwieństwie do białek palców cynkowych, nie było re-inżynierii powiązania między powtórzeniami niezbędnymi do budowy długich tablic Opowieści z możliwością teoretycznie adresowania pojedynczych miejsc w genomie. Oprócz ich roli w ułatwianiu HDR (homologicznej bezpośredniej rekombinacji), specyficzne dla danego miejsca nukleazy umożliwiają również szybkie wytwarzanie linii komórkowych i organizmów o zerowych fenotypach; Nhej-mediowana naprawa DSB indukowanego nukleazą prowadzi do wprowadzenia małych insercji lub delecji w docelowym miejscu, powodując nokaut funkcji genu poprzez mutacje frame-shift.

Obraz zaczerpnięty z http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

w odróżnieniu od opisanych powyżej nukleaz specyficznych dla danego miejsca, system CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated (Cas) pojawił się niedawno jako potencjalnie łatwa i skuteczna alternatywa dla Zfns i TALENs do indukowania ukierunkowanych zmian genetycznych. U bakterii system CRISPR zapewnia nabytą odporność przed inwazją obcego DNA poprzez rozszczepianie DNA kierowane RNA. W systemie CRISPR/Cas typu II, krótkie segmenty obcego DNA, określane jako „odstępy”, są zintegrowane w loci genomu CRISPR i transkrybowane i przetwarzane w krótki RNA CRISPR (crrna). Te crrna wyżarzają się do trans-aktywujących crrna (tracrrna) i bezpośredniego sekwencyjnego rozszczepiania i wyciszania patogennego DNA przez białka Cas. Ostatnie prace wykazały, że rozpoznawanie celu przez białko Cas9 wymaga sekwencji „nasiennej” w obrębie crRNA i zachowywanej sekwencji protospacera zawierającego dinukleotyd (Pam) przed regionem wiążącym crRNA. System CRISPR / Cas może być zatem ponownie ukierunkowany na rozszczepianie praktycznie każdej sekwencji DNA poprzez przeprojektowanie crRNA. Co istotne, wykazano, że system CRISPR/Cas jest bezpośrednio przenośny do komórek ludzkich przez współwystępowanie plazmidów wyrażających endonukleazę Cas9 i niezbędnych składników crRNA.

Zdjęcie pochodzi z https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php