High Fidelity & Efficient PCR enzym: kod DNA polymerase
hyperthermophilic archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (wcześniej Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (rys. 1) został wyizolowany z solfatarycznego gorącego źródła (rys. 2) na wyspie Kodakara (rys. 3) w Japonii i został zidentyfikowany i scharakteryzowany.
polimeraza DNA rodziny B (polimeraza DNA KOD) została znaleziona w tym szczepie KOD1 i wykazuje różne unikalne właściwości (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (Wyspa Kodakara, Japonia)
-
Fig. 3. Kodakara island (Prefektura Kagoshima, Japonia)
polimeraza DNA KOD wykazuje silną aktywność egzonukleazy 3 '→5 ’ (aktywność sprawdzająca), aktywność której brakuje polimerazie DNA TAQ.
co więcej, enzym ten wykazuje doskonałą zdolność procesywności i wydłużania, wykazując pięciokrotnie większą szybkość wydłużania (100-130 nukleotydów/sekundę) i 10-15 razy większą procesywność (>300 zasad) niż u Pyrococcus furiosus (polimeraza DNA Pfu). Szybkość wydłużania tego enzymu jest około 2 razy wyższa niż polimerazy DNA TAQ (Tabela 1) (Fig. 4) (1).
Tabela 1. Właściwości termostabilnych polimeraz DNA
| Proterty | wartość dla wskazanej polimerazy DNA | ||
|---|---|---|---|
| polimeraza DNA KOD | polimeraza DNA Pfu | polimeraza DNA Taq | |
| pochodzenie | Archaea | Archaea | bakterie |
| wydedukowana Masa cząsteczkowa (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optymalna temperatura (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| optymalne pH przy 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| termostabilność (okres półtrwania) | 95ºC,12 h; 100oC,3,0 h | 95ºC, 6h; 100ºC, 2,9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Porównanie szybkości wydłużania polimerazy DNA KOD Pfu i Taq.
szybkość wydłużenia mierzono w zależności od długości zsyntetyzowanego DNA, używając jako szablonu M13 ssDNA w temperaturze 75ºC.
równolegle z badaniem aktywności polimerazy DNA KOD, opracowano przeciwciała neutralizujące dla polimerazy i działania korygujące (2). Przeciwciała te można zastosować do „technologii hot start PCR” przy użyciu polimerazy DNA KOD.
struktura 3-D polimerazy DNA została scharakteryzowana w 2003 roku (Fig. 5) (3).
Fig. 5. 3-D struktura polimerazy DNA KOD
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (Nr kodu KOD-201) został opracowany w oparciu o polimerazę DNA KOD i wykazuje wysoką wierność PCR (Table2).
Tabela 2. Porównanie częstotliwości mutacji każdego enzymu PCR.
| Liczba zmutowanych zasad | częstotliwość mutacji (x10-5) | ||
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| polimeraza DNA Pfu | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-bazowy enzym long-PCR | 167,343 | 218 | 130.3 |
| polimeraza DNA TAQ | 102,708 | 145 | 141.2 |
Fidelity mierzono jako częstotliwość mutacji poprzez sekwencjonowanie produktu PCR. Po sklonowaniu produktu PCR (2,4 kb ludzkiego regionu beta-globiny) wybrano i zsekwencjonowano około 96 klonów.
KOD FX (nr kodu KFX-101) został opracowany w oparciu o polimerazę DNA KOD i wykazuje znacznie większą skuteczność PCR (w oparciu o wydajność i możliwości wydłużenia) niż KOD-Plus- (Nr kodu. KOD-201) lub inne enzymy PCR oparte na Taq. KOD FX jest również skuteczny w amplifikacji z surowych okazów (np. lizat ogona myszy, hodowane komórki).
Fig. 6. Bezpośrednie wzmocnienie z surowego lizatu ogona myszy
1,2: KOD FX
3~6: enzymy innych firm
M: markery
