C. poliakrylamid osadzony w kulkach fluorescencyjnych
jak opisano w poprzednim rozdziale, podłoża krzemowe okazały się cenne w pomiarze sił wywieranych przez szybko poruszające się keratocyty. Jednak te same substraty są znacznie mniej przydatne do badania większości komórek ssaków. Aby trakcje były dokładnie obliczone, substrat musi być dostrojony tak, aby pasował do ruchliwości i generowania siły danego typu komórki. Trudno jest dokładnie wytworzyć podłoże krzemowe o pożądanej zgodności dla wolniej poruszających się komórek zdolnych do wywierania większych sił. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, Dembo i Wang (1999) użyli podłoża z poliakrylamidu osadzonego z submikrometrowymi kulkami fluorescencyjnymi. Zgodność substratów poliakrylamidowych można dostrajać chemicznie przez zmianę stężenia monomeru i sieciującego (Pelham and Wang, 1997). Poliakrylamid ma kilka dodatkowych zalet w porównaniu z podłożem krzemowym. W szerokim zakresie odkształceń wykazuje liniowo elastyczne zachowanie. Ponadto poliakrylamid nie nadaje się zazwyczaj do samodzielnego wiązania komórek, bez koniugacji specyficznych ligandów adhezji komórkowej(Nelson et al., 2003). Dlatego jest to idealne rusztowanie do badania adhezji i zachowania komórek w kontrolowany, zdefiniowany sposób.
metoda obliczeniowa, za pomocą której deformacje w substracie są stosowane do określenia trakcji wywieranych przez komórkę, jest bardzo podobna do metod stosowanych na wyżej wymienionych obciążonych podłożach krzemowych. Jednak użycie znaczników fluorescencyjnych znacznie poprawiło metodę śledzenia i zdolność do obliczania dokładnego pola odkształcenia.
Dembo i Wang opublikowali kilka badań z wykorzystaniem uzyskanej techniki, mikroskopii siły pociągowej, która wyjaśnia mechanizmy migracji fibroblastów. W szczególności wykazali, że lamellipodia komórki zapewniają prawie całą siłę potrzebną do poruszania się do przodu(Munevar et al., 2001a). Ich wyniki wskazują, że lamellipodium jest jednostką mechaniczną odrębną od reszty ciała komórkowego. Co ciekawe, ten sam podział mechaniczny w komórce wydaje się nie istnieć w komórkach transformowanych H-ras, być może wyjaśniając różnicę w ich zachowaniu ruchowym. Dodatkowo, Beningo et al. (2001) badał rolę ogniskowych zrostów w regulacji generowania trakcji i odkrył, że rozmiar ogniskowych zrostów jest odwrotnie związany z ilością generowanej siły. Ponadto rozkład zrostów nie odpowiada dobrze rozkładowi sił trakcyjnych. Autorzy wnioskują, że wyniki te mogą wskazywać, że wczesne kompleksy ogniskowe są odpowiedzialne za silne siły napędowe, a dojrzewanie tych miejsc adhezji powoduje zmianę w pasywne miejsca kotwiczenia — wniosek, który był szeroko omawiany w literaturze. Dodatkowo Dembo i współpracownicy zbadali dynamiczne role, które zrosty przedni-kontra-tylny(Munevar et al., 2001B), myosin IIb (Lo et al., 2004), ogniskowa kinaza adhezyjna (Wang et al., 2001), a aktywowane rozciąganiem kanały Ca2+ grają w migracji fibroblastów (Munevar et al., 2004). Korzystając z mikroskopii siły trakcyjnej, Dembo i współpracownicy poczynili znaczne postępy w zrozumieniu roli generowania siły w migracji fibroblastów.
jednym z najważniejszych osiągnięć technicznych przy użyciu żelu poliakrylamidowego jest zdolność do niezawodnego kontrolowania zgodności podłoża komórkowego bez zmiany gęstości ECM. Dostrojenie zgodności substratu było krytycznym punktem zwrotnym w rozwoju mikroskopii siły pociągowej, ponieważ pozwoliło na zbadanie prawie każdego rodzaju komórek i zrozumienie zachowania komórek jako funkcji środowiska mechanicznego. Przed badaniem przeprowadzonym przez Pelhama i Wanga (1997) większość badań badających migrację komórek i adhezję koncentrowała się na migracji komórek w odpowiedzi na rozpuszczalne środowisko chemiczne (chemotaksja) lub w odpowiedzi na ligand sprzężony z substratem (haptotaksja). Dodatkowo, badania z udziałem środowiska mechanicznego komórki koncentrowały się na reakcji spowodowanej nałożonymi siłami, takimi jak naprężenia ścinające płyn i rozciąganie mechaniczne. Jednak zmieniając sztywność podłoża, Pelham and Wang (1997) stworzyli znaczącą zmianę w sposobie, w jaki naukowcy podchodzą do odpowiedzi komórkowej i mechanotransdukcji. Stosując podłoże poliakrylamidowe, Pelham i Wang utrzymywali gęstość ECM na podłożu na stałym poziomie, jednocześnie zmieniając zgodność mechaniczną. Wykazano, że fibroblasty są zdolne do aktywnej reakcji na mechaniczną zgodność ich substratu. Komórki na żelach sztywniejszych są bardziej rozprzestrzeniane i migrują wolniej niż komórki na żelach bardziej zgodnych. Ponadto zdolność komórek do wyczuwania mechanicznej zgodności ich substratu znajduje odzwierciedlenie w ich zdolności do zmiany stanu fosforylacji licznych białek zawartych w ogniskowej strukturze adhezyjnej. Zrosty ogniskowe na sztywnych podłożach są większe, bardziej wydłużone i bardziej stabilne, podczas gdy zrosty ogniskowe na podłożach bardziej zgodnych zawierają mniej fosforylowanych pp125FAK i paxillin i pojawiają się znacznie bardziej nieregularnie. Wyniki te jako pierwsze sugerowały, że mechaniczne sygnały ECM mogą być równie ważne jak sygnały chemiczne w regulacji adhezji komórek.
od czasu przełomowego artykułu Pelhama i Wanga (1997), wiele badań zbadało wpływ zgodności na zachowanie komórek. Lo i in. (2000) wykorzystano chemię poliakrylamidową do stworzenia podłoża zawierającego stopień sztywności — Centralny region podłoża, w którym spotykają się dwa substraty o różnych zgodnościach. Wykazali zachowanie zwane durotaxis, dzięki któremu komórki były w stanie aktywnie wykrywać i reagować na zmiany w zgodności substratu. Komórki, które migrowały na miękkim podłożu, po uderzeniu w granicę przejścia sztywno-miękkiego, krzyżowały się na sztywnym podłożu, podczas gdy komórki na sztywnych podłożach wykazywały wyższe trakcje i bardziej rozłożony obszar i albo wycofywały się, albo zmieniały kierunki w odpowiedzi na granicę sztywno–miękką. Później, Wong et al. (2003) zbadał zdolność fibroblastów do migracji na hydrożelach poliakryloamidowych zawierających gradienty zgodności, a nie krok, jak to zrobili Lo i współpracownicy. Odkryli, że komórki mięśni gładkich naczyń mają tendencję do szybszej migracji na bardziej miękkich podłożach niż na sztywniejszych podłożach (15 kPa vs 25 kPa), a komórki mają tendencję do gromadzenia się na sztywniejszych podłożach. Co więcej, wzór migracji na żel zgodny z gradientem wydawał się być skierowany w kierunku sztywniejszych regionów żelu, zamiast wykazywać typowy losowy wzór chodzenia charakterystyczny dla migracji komórek. Engler et al. (2004) dalej badał odpowiedź komórek na żele zgodne i wykazał, że odpowiedź jest w dużej części pośredniczona przez montaż cytoszkieletu aktyny. Badając zmiany w cytoszkielecie, Engler i współpracownicy byli w stanie wykazać, że lekka nadekspresja aktyny w komórce może zrekompensować utratę rozprzestrzeniania się obserwowaną w odpowiedziach na miękkie żele. Ponadto Yeung et al. (2005) wykazały, że próg czułości dla wykrywania zgodności jest specyficzny dla typu komórki i że kontakty komórka–komórka mogą również pomóc w ratowaniu zmian morfologicznych obserwowanych w miękkich podłożach, aby bardziej przypominać morfologię komórek na sztywniejszych podłożach (Yeung et al., 2005). Ogólnie rzecz biorąc, badania nad durotaxis są wciąż stosunkowo młode i wiele pozostaje do nauczenia się o tym, jak komórka mechanicznie wyczuwa i reaguje na właściwości materialne swojego podłoża i środowiska.
