2.3.4.1 struktura
homodimer apo-sCTLA-4 został wyrażony w komórkach CHO jako białko fuzyjne Fc z rozdzielaniem trombiny w obecności kifunensyny.23 Po deglikozylacji, homodimer dał kryształy dyfrakcyjne do przestrzeni Bragga o wymiarach 1,8 Å, o wymiarach komórek jednostkowych a = 43,86 Å, b = 51,46 Å i c = 102,85 Å, oraz grupy przestrzeni P212121 (Ref. 130). Struktura została rozwiązana przez zastąpienie molekularne. Jednostka asymetryczna składała się z homodimeru wiązanego dwusiarczkami, co umożliwiało porównanie z kompleksami sCTLA-4/SB7-1 i sCTLA-4/SB7-2 oraz z sCTLA-4 związanym z inżynierską lipokaliną.131
dwa monomery w jednostce asymetrycznej składały się z domen β-kanapkowych o topologii AGFCC i ABED, zgodnie z przewidywaniami Metzlera i in.132 krótka „łodyga” dwusiarczków ” wiązana w Cys122 łączyła domeny IgSF z błoną. Nieoczekiwanie, dwie połówki homodimeru apo-CTLA-4 były mniej podobne do siebie niż do swoich skompleksowanych odpowiedników, podkreślając, że wiązaniu nie towarzyszą wielkoskalowe przearanżowania strukturalne (Fig. 2,2 H). Zautomatyzowane porównania struktur zidentyfikowały CD28 i PD – 1 jako struktury najbardziej podobne do CTLA-4. Istotne różnice między CTLA – 4 i CD28 były: (i) obecność załamania w nici β G CD28, (ii) zmiany wielkości pętli, w tym rozszerzone pętle AB, BC i CC’ w CTLA-4 i obcięta pętla C”D, oraz (iii) Wiązanie H nici β C’ i C” wynikające z zmiany położenia pętli C 'C” w CD28. Kluczowe znaczenie miała w dużej mierze identyczna konformacja sekwencji pętli FG 99myppy104 tworzącej rdzeń ich powierzchni wiążących ligand. Na wyjątkowo suchej powierzchni apo-CTLA-4 można było znaleźć tylko jedną cząsteczkę wody, podczas gdy w innych miejscach wykryto 228 wód.
po CD28 i PD-1, kolejnymi najbardziej podobnymi strukturami do domeny zestawu V CTLA-4 były 215 przeciwciała lub domeny V TCR, różniące się głównie tylko długością pętli. R. m. s. różnica dla superpozycji CTLA-4 z najbardziej podobną domeną TCR Va wynosiła 2,09 Å dla 102 reszt, w przeciwieństwie do 2,89 Å dla 86 reszt dla superpozycji z D1 CD2. Ważne cechy wspólne z domeną Va obejmowały długą pętlę CC 'i zachowane wybrzuszenia β w łańcuchach C’ i G β nakładające wyraźny skręt na arkuszu β AGFCC’. Na szczególną uwagę zasługuje wysoki stopień zachowania sekwencji i konformacji Ca w pobliżu pasma g β-bulge, czyli GNGTQIYV (CTLA-4) i GDGTQLVV (Va). W CD2 i CTLA-4 pętle były podobne, a domeny różniły się o tyle, że: (i) w CD2 nie było wiązania H nici ßA i ßB, (ii) nie było skręcania arkusza β” GFCC” w CD2 z powodu zmiany położenia β-wybrzuszeń, (iii) pozycja nici c „β w CD2, ale nie CTLA-4 pozwalała na kanoniczne Wiązanie H i przedłużenie arkusza β AGFCC „C”, oraz (iv) CTLA-4 nie było skręcania w pętli FG obecnej w CD2 (a także, np., B7-1). Analiza pięćdziesięciu dwóch domen IgSF z zestawem V przy użyciu sekwencyjnego programu wyrównywania struktur133 wykazała, że rodzina CD28/CTLA-4 obejmuje podgrupę domen z zestawem V odrębną od grup CD8, receptorów antygenowych i cząsteczek „adhezyjnych”, na przykład B7-1 i CD2. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono większe podobieństwo podgrupy CD28/CTLA-4 do rodziny receptorów antygenowych w porównaniu z zestawem adhezji. Analiza sugerowała, że białka i receptory antygenowe z rodziny CD28/CTLA-4 mają wspólnego przodka, prawdopodobnie podobnego do PD-1, przy czym obie rodziny różnią się wcześnie.
Apo-CTLA-4 zawierał homodimer z jego podjednostkami przyjmującymi układ sprzyjający ortogonalnym oddziaływaniom dwuwartościowym z ligandami umieszczonymi na powierzchniach komórek. Porównanie z parami monomerów CTLA – 4 w kompleksach B7-1 i B7-2106,107 i monomerem w kompleksie lipokalin131 wykazało bardzo ograniczoną elastyczność obrotową na styku homodimeru i niezwykle niewiele, jeśli w ogóle, zmian przypisywanych wiązaniu ligandu. Jedyne różnice były widoczne w kompleksie B7 – 2, z lekkim przesunięciem pętli BC i CC’, oraz nici β c” i sąsiednich pętli, oraz różnicami konformacyjnymi w nici β g na jej końcu C. Te lokalne różnice były odległe od miejsca wiązania ligandu CTLA-4 i w żadnym przypadku monomery apo nie różniły się systematycznie od wszystkich pięciu skompleksowanych monomerów CTLA – 4. Główne pozycje atomów łańcucha sekwencji 99myppy104 były zasadniczo identyczne.
struktury kompleksów utworzonych przez CTLA-4 z B7-1 i B7-2, które wcześniej nie były porównywane, były zupełnie inne.130 podstawienie w B7-2, Val28 vs Arg29 w B7-1, utworzyło kieszeń wiążącą W B7-2, która została tylko częściowo wypełniona przez CTLA-4. Zapewniło to, że kompleks B7-1/CTLA-4 wykazywał lepszą komplementarność kształtu niż kompleks B7-2/CTLA-4. Kompensując to nieco, pole powierzchni Zakopane w B7 – 2 przez CTLA-4 było nieco większe niż w przypadku B7-1. Ogólnie rzecz biorąc, B7-1 wiązał CTLA-4 w jeszcze bardziej sztywny sposób podobny do ciała niż CTLA-4 angażował B7-1. Wiązanie B7-2 przez CTLA-4 było jednak bardziej złożone i nosiło znamię „pasowania indukowanego.”W CTLA – 4 bound-vs apo-B7-2 nastąpiło przesunięcie 2,3-3,5 Å pętli B7-2 FG w kierunku CTLA-4, które zostało zainicjowane przez obrót Phe31 B7-2 o ~ 120 stopni (Ref. 130). Spowodowało to interakcję phe31 z Pro102 sekwencji 99MYPPY104 CTLA-4.
