Kruppel-like factor 2 (KLF2) reguluje prozapalną aktywację monocytów

wyniki

ekspresja KLF2 zmniejsza się wraz z aktywacją/różnicowaniem monocytów w makrofagi.

aby lepiej zrozumieć rolę KLF2 w regulacji komórek odpornościowych, takich jak monocyty/makrofagi, najpierw oceniliśmy ekspresję KLF2 w pierwotnych monocytach ludzkich. Jak pokazano na Fig. 1 ekspresja lewej, KLF2 jest silna w pierwotnych monocytach ludzkich i silnie zmniejszona wraz z różnicowaniem w makrofagi po 5 dniach. Ekspresja KLF2 w ludzkiej monocytowej linii komórkowej THP-1 była znacznie niższa niż w pierwotnych monocytach ludzkich. Jednakże ekspresja była dalej zmniejszona po potraktowaniu tych komórek LPS lub 12-o-tetradekanoiloforbol-13-octanem, dwoma środkami dobrze ustalonymi do indukowania aktywacji lub różnicowania komórkowego (Fig . 1 A Prawa).

następnie staraliśmy się ustalić, czy ekspresja KLF2 jest regulowana w Warunkach zapalnych in vivo. Aktywacja monocytowa jest kluczowym zdarzeniem patofizjologicznym w rozwoju miażdżycy, przewlekłego stanu zapalnego o niskim stopniu zaawansowania, dlatego uznaliśmy, że ekspresja KLF2 może być zmniejszona u tych pacjentów (11). Zbadaliśmy grupę 14 osób w normalnym wieku i 14 pacjentów z rozległą miażdżycą (≈50% z rewaskularyzacją tętnic wieńcowych w wywiadzie), którzy są stratyfikowani przez najniższy i najwyższy poziom genu kostniakomięsaka Finkela–Biskis–Jinkinsa (FOS), który okazał się być markerem stanu zapalnego (12). Jak pokazano na Fig. 1 B, ekspresja KLF2 była znacząco zmniejszona o ≈30% u pacjentów. Natomiast nie zaobserwowano istotnego wpływu na KLF3, KLF6, KLF11 i KLF13. Zgodnie z naszym poprzednim badaniem ekspresja FOS była znacznie zwiększona u pacjentów z chorobą wieńcową (12).

KLF2 hamuje aktywację monocytów i zdolność fagocytarną.

w odpowiedzi na bodźce zapalne, monocyty wyrażają zwiększony poziom czynników prozapalnych i cytokin/chemokin oraz wykazują zwiększoną zdolność fagocytarną. Aby uzyskać wgląd w rolę KLF2 w funkcji monocytów, podjęliśmy badania nadekspresji. Komórki THP-1 zakażono pustym wirusem kontrolnym (EV) lub klf2 (Ad-KLF2) przez 24-48 godzin, a następnie stymulowano LPS przez 2 i 6 godzin. jak pokazano na Fig. 2 A, leczenie komórek zakażonych EV za pomocą LPS (25 ng/ml) spowodowało silną indukcję cyklooksygenazy (COX)-2, czynnika tkankowego i mRNA monocytów (MCP)-1. Natomiast indukcja ta była znacznie atenuowana w komórkach zakażonych KLF2 (Fig. 2 A). Podobne działania obserwowano również w mysich liniach komórkowych monocytów J774a (dane nie zostały przedstawione). Ponadto nadekspresja KLF2 silnie hamowała wydzielanie różnych cytokin i chemokin. Jak pokazano na Fig. 2 B, nadekspresja KLF2 osłabiała indukcję czynników, takich jak CD40L (o 49,6%), białko zapalne makrofagów 1α (48,4%), białko zapalne makrofagów 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) i MCP-1 (68,8%). Efekt ten był specyficzny, ponieważ nie zaobserwowano istotnego wpływu na poziomy wielu innych istotnych czynników wzrostu (tgfß1, płytkopochodnego czynnika wzrostu i czynnika stymulującego kolonie granulocytów/makrofagów), cytokin/chemokin (IL-4, IL-10, IL-12P40, IL-12P70, IL-1α i IFN-γ) lub enzymów zmieniających matrycę (typy metaloproteinazy matrycy 1, 2, 3 i 9) (brak danych).

klasyczną cechą aktywowanych monocytów / makrofagów jest fagocytoza. Aby określić, czy nadekspresja KLF2 wpływa na zdolność fagocytarną monocytów, nadekspresję KLF2 lub kontrolną (EV) w komórkach THP-1, stymulowaną LPS i oceniono zdolność tych komórek do pobierania biopsji Zymozanu a oznaczonego czerwono. Jak pokazano na Fig. 2 C, komórki zakażone wirusem kontrolnym połknęły biopartykuły zymosanu. Natomiast wychwyt przez monocyty wyrażające KLF2 był znacznie zmniejszony (Fig. 2 C). Łącznie dane te pokazują, że KLF2 może hamować wydzielanie monocytów przez cytokiny / chemokiny i fagocytozę.

KLF2 nie hamuje rekrutacji monocytów.

następnie staraliśmy się ocenić wpływ KLF2 na funkcję monocytów in vivo. W odpowiedzi na uraz lub bodziec zapalny, monocyty są rekrutowane z krwiobiegu do tkanek. Najpierw podjęliśmy badania, aby ocenić, czy Rekrutacja monocytów została zmieniona przez ekspresję KLF2. Aby zminimalizować udział innych typów komórek, użyliśmy myszy C. B-17-Scid-beige, które mają niedobór komórek T, B i naturalnych zabójców. Zwierzęta te (N = 5 na Grupę) poddano następnie napromieniowaniu całego ciała i odtworzono w komórkach j774a adenowiralnie zakażonych wirusem kontrolnym (EV) lub KLF2 za pomocą wstrzyknięcia żyły ogonowej (opisanego w materiałach i sposobach). Następnie zwierzęta poddano iniekcji IP tioglikolanu (silny środek drażniący, który indukuje rekrutację monocytów), a liczbę komórek GFP-dodatnich oceniono 48 godzin później za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej. Jak pokazano na Fig. 2 C I d, KLF2 nie hamował rekrutacji monocytów GFP + J774a do jamy otrzewnej. Rzeczywiście, w sposób powtarzalny zaobserwowaliśmy, że zwierzęta transdukowane KLF2 wykazywały znaczny wzrost komórek GFP+. Dane te sugerują, że KLF2 nie hamuje, ale raczej zwiększa rekrutację monocytową do miejsca zapalnego.

KLF2 hamuje stany zapalne wywołane Karagenianem.

po rekrutacji i migracji do tkanek monocyty wydzielają cytokiny, chemokiny i czynniki wzrostu w celu utrwalenia odpowiedzi zapalnej. Jak pokazano na Fig. 2 B, zauważyliśmy, że nadekspresja KLF2 osłabiła opracowanie kilku cytokin i chemokin. Aby ustalić, czy klf2 wpływa na monocytową funkcję zapalną, wykorzystaliśmy dobrze ugruntowany model zapalenia: wstrzyknięcie podnóżka wywołane karagenem. Wcześniej wykazano, że wstrzyknięcie tej substancji chemicznej w sposób powtarzalny indukuje reakcję zapalną charakteryzującą się obrzękiem łap (13-15). Myszy C. B-17-Scid-beżowe (n = 4 na Grupę) napromieniowano, jak opisano powyżej, odtwarzano z komórkami kontrolnymi lub ekspresującymi Klf2 J774a, a następnie kwestionowano wstrzyknięciem karagenanu w stopkę (opisano w materiałach i sposobach). Objętość łap oznaczono za pomocą hydropletismometru zmodyfikowanego dla małych objętości (ugo Basile, Mediolan). Jak pokazano na Fig. 2 F, zakażone EV zwierzęta wykazywały wzrost objętości łap odpowiednio o 17 ± 1,08-mm3 i 23,3 ± 3,05-mm3 po 1 i 2 h iniekcji karagenanu. W przeciwieństwie do tego, zwierzęta rozpuszczone w komórkach j774a z ekspresją KLF2 wykazywały tylko wzrost objętości łap o 6,25 ± 0,85 mm3 i 7,5 ± 0,95 mm3 odpowiednio po 1 i 2 h po wstrzyknięciu karagenu (Fig. 2 F). Zgodnie z tym ogromnym efektem, analiza histologiczna łap wykazała zmniejszone wynaczynienie płynu, co prowadzi do powstawania obrzęków (Fig. 2 G, strzałki).

wpływ Knockdown KLF2 na ekspresję genów zapalnych.

aby określić znaczenie KLF2 w monocytowej ekspresji genów zapalnych, przeprowadzono również badania knockdown z udziałem małego interferingującego RNA (siRNA). Jak pokazano na Fig. 2 H, w porównaniu z nieleczonymi (kontrolnymi) i niespecyficznymi komórkami leczonymi siRNA, knockdown KLF2 (≈60% knockdown) w komórkach J774a spowodowało indukcję genów zapalnych, takich jak MCP-1 i bardziej skromny wpływ na poziomy ekspresji COX-2 i czynnika tkankowego. Wyniki te zostały również zweryfikowane za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym (rys. 2 I).

KLF2 hamuje działania promotorów NF-kB I AP-1.

KLF2 może silnie hamować indukcję MCP-1, COX-2 i czynnika tkankowego za pośrednictwem LPS (Fig. 2 A). Wiadomo, że indukcja tych celów przez bodźce prozapalne jest regulowana przez szlaki transkrypcyjne, takie jak NF-kB I AP-1. Uznaliśmy, że zasadniczo KLF2 może hamować te szlaki na wielu poziomach, takich jak ekspresja, Wiązanie DNA lub indukcja aktywności transkrypcyjnej.

najpierw skupiliśmy się na NF-kB, biorąc pod uwagę jego główną rolę w stanach zapalnych. Nadekspresja KLF2 nie zmieniła nagromadzenia P65 lub poziomów kinazy IkB (IKK) α i IKKy (Fig. 3 A). Ponadto nadekspresja KLF2 nie zmieniła kinetyki fosforylacji IkB lub degradacji ani poziomu cytoplazmatycznego IKKa, IKKß i IKKy(Fig. 3 B). Zgodnie z tymi obserwacjami KLF2 nie wpływa na Wiązanie NF-kB z DNA. Jak pokazano na Fig. 3 C, Leczenie komórek zakażonych wirusem kontrolnym (EV) LPS wywołało jedno główne pasmo. Badania konkurencji i supershift potwierdziły, że pasmo to reprezentuje NF-κΒ. Prawie identyczny wzór wiązania NF-kB zaobserwowano w komórkach NADEKSPRESUJĄCYCH KLF2. Aby ocenić, czy KLF2 może wpływać na aktywację transkrypcyjną za pośrednictwem NF-kB, przeprowadzono testy reporterowe genów. Jak pokazano na Fig. 3 D, transfekcja p65 plazmidem reporterowym lucyferazy NF-kB indukowała aktywność transkrypcyjną ≈11 razy. Indukcja ta była silnie zmniejszona w obecności KLF2, co wskazuje, że KLF2 hamuje aktywność transkrypcyjną NF-kB. Podobne efekty działania KLF2 zaobserwowano dla szlaku AP-1 (Fig. 5 A-C, które są publikowane jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS).

Rekrutacja czynnika związanego z Koaktywatorem CBP (PCAF) przez KLF2 jako mechanizmu jednoczącego.

razem, Wyniki na Rys. 3 wskazują, że KLF2 może hamować transaktywację za pośrednictwem NF-kB niezależnie od wpływu na Wiązanie DNA tych czynników. Jednym z możliwych mechanizmów jest Rekrutacja krytycznych współaktywatorów. Na przykład optymalne Wiązanie NF-kB wymaga interakcji z kilkoma kluczowymi koactivatorami, takimi jak koactivator receptora steroidowego (SRC)-1, PCAF i p300/CBP. KLF2 może wchodzić w interakcje z jednym lub kilkoma z tych czynników, rekrutować je z dala od NF-kB i, w konsekwencji, zmniejszać aktywność transkrypcyjną za pośrednictwem NF-kB.

w celu określenia roli PCAF w hamowaniu aktywności transkrypcyjnej NF-kB za pośrednictwem KLF2 wykonaliśmy badania kot-sekcyjne z egzogennym PCAF. Transfekcja PCAF (ale nie p300; dane nie pokazano) znacznie uratował KLF2-pośredniczące represję NF-kB konkatemer (rys. 4 A). Zaobserwowano również częściowe ratowanie zdolności KLF2 do hamowania aktywności transkrypcyjnej AP-1 (Fig. 5D). Aby ustalić, czy KLF2 i PCAF oddziałują ze sobą, wykonaliśmy testy GST pull-down i coimmunoprecipitation. Korzystając z transkrybowanych i translowanych produktów in vitro, odkryliśmy, że KLF2 i PCAF mogą oddziaływać bezpośrednio w systemie wolnym od komórek (rys. 4 B). Aby dowiedzieć się, czy PCAF wiąże się z klf2 in vivo, nadekspresowaliśmy KLF2 (oznaczony hemaglutyniną) i PCAF (oznaczony flagą) w komórkach COS-7. Immunoprecypitacja z przeciwciałem anty-Flag, a następnie Western blotting z przeciwciałem anty-hemaglutyniny wykazały, że KLF2 wiąże się z PCAF w komórkach (Fig. 4 C).

aby ustalić, czy mechanizmy leżące u podstaw obserwowanych efektów działają in vivo, podjęliśmy badania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). Zgodnie z oczekiwaniami, stymulacja LPS komórek THP-1 doprowadziła do rekrutacji p65 i PCAF do promotora COX-2 (Fig. 4 D). Ponadto obserwowano równoczesną acetylację HH3 i HH4. Jednak w kontekście nadekspresji KLF2 Rekrutacja PCAF i acetylacja histonów są silnie atenuowane (Fig. 4 D). Zgodnie z naszymi testami Gel-shift, nie zaobserwowano znaczącego wpływu klf2 na rekrutację p65.