dyskusja
obserwowana produkcja wysokich poziomów aktywności proteazy podczas ciągłej hodowli K. sedentarius ułatwiał oczyszczanie dwóch proteaz, P1 i P2, które były aktywne wobec azokaseiny, łańcucha β insuliny, keratyny ekstrahowanej z ludzkiego kalusa i nieprzetworzonego kalusa. Ogólna charakterystyka tych enzymów, w tym zakres substratów, optymalna temperatura i pH oraz wrażliwość na inhibitory proteazy sugerują, że są one biochemicznie podobne i prawdopodobnie należą do rodziny alkalicznych proteaz serynowych. Proteazy te są wytwarzane przez wiele różnych mikroorganizmów i działają jako endopeptydazy (Rao et al. 1998).
to, czy enzymy można również zaklasyfikować jako keratynazy, pozostaje jednak kwestią dyskusji. Keratynazy z definicji powinny być zdolne do hydrolizy czystej natywnej keratyny. Ekstrakcję keratyny można jednak osiągnąć tylko przez wcześniejsze leczenie środkami denaturującymi w celu oddzielenia jej od białek innych niż keratyna. Obróbka mechaniczna, taka jak mielenie kulkowe, powoduje rozszczepienie wiązań dwusiarczkowych, które czynią białko bardziej podatnym na trawienie proteolityczne przez proteazy, takie jak trypsyna i proteinaza K, które nie są klasyfikowane jako keratynazy (Noval and Nickerson 1959). Podobnie krytykowano również stosowanie sterylizowanych termicznie substratów w testach keratynazowych, ponieważ ogrzewanie może powodować denaturację keratyny.
chociaż w niniejszym badaniu drobno zmielony kalus został użyty jako substrat enzymatyczny, płyn supernatantowy z hodowli był aktywny przeciwko kawałkom nienaruszonego kalusa. Dlatego nawet jeśli te dwie proteazy nie są ściśle keratynazami, degradują one ludzkie kalusy in vitro i istnieją pewne dowody na to, że występuje to również In vivo(Nordstrom et al. 1987).
proteazy zostały również sklasyfikowane jako Keratynazy ze względu na ich aktywność na zmniejszoną keratynę, w którym to przypadku środki redukujące zostały dodane do mieszaniny enzymów lub użyte podczas ekstrakcji keratyny. Chociaż działanie keratynolityczne szeregu bakterii skórnych badano stosując „natywną” keratynę jako substrat, do mieszaniny testowej włączono środek redukujący, ditiotreitol (DTT). Na przykład, gdy pozorna aktywność keratynazy z Staphylococcus epidermidis była badana przy braku DTT, nie wykryto aktywności (Mikx i de Jong 1987). Podobnie, proteaza serynowa z Candida albicans‐zdegradowanych keratyn, które zostały wyekstrahowane z warstwy rogowej ludzkich podeszew z 8 mol L−1 mocznika w Tris‐HCl i β‐merkaptoetanolu (Hattori i wsp. 1984). W niniejszym badaniu P1 i P2 hydrolizowały keratynę, która została wyekstrahowana z kalusa stopy ludzkiej moczem i β-merkaptoetanolem, ale, co ważne, była również w stanie degradować nieleczony kalus.
warstwa rogowa i kalus ludzki są złożoną i stabilną strukturą, której głównym składnikiem jest keratyna. Istnieje 30 ludzkich genów dla keratyny, z których 18 ulega ekspresji na skórze (Fuchs 1995). Podsumowanie bazy danych keratyny wykazało, że każda keratyna ma potencjalne miejsca rozszczepiania proteaz, a Asp‐Arg i Gly‐Arg są najczęstsze. Jeśli włókna keratynowe są początkowo łamane w tych miejscach, możliwe jest, że stopniowa degradacja tych mniejszych jednostek zachodzi w miejscach wtórnego rozszczepiania, wytwarzając zakres rozmiarów fragmentów peptydowych, jak pokazano w analizie ataku proteazy na keratyny ekstrahowane z ludzkiego kalusa. Wyniki przedstawione na Rys. 3b wskazać dwie wartości pH optima dla kalusowej aktywności degradującej P2. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że w próbce znajdują się dwa enzymy. Wydaje się to mało prawdopodobne, ponieważ użyta próbka enzymu była wysoce oczyszczona, jak pokazano na stronie z zabarwieniem srebrem (patrz ryc. 1, pas 6). Nie można wykluczyć istnienia dwóch enzymów rozkładających kalus w oczyszczonej próbce P2 o bardzo podobnej ruchliwości na stronie. Jednak tę samą próbkę testowano przy użyciu tych samych buforów w teście azokaseiny i wykryto tylko jedno optimum pH przy pH 10·2. Alternatywnym wyjaśnieniem jest to, że złożona interakcja substrat/enzym kalusa w różnych pHs jest równowagą aktywności enzymu i subtelnych zmian konformacyjnych substratu, co prowadzi do podwójnego pH optima.
to badanie wykazało, że K. sedentarius wytwarza dwie zewnątrzkomórkowe proteazy, które wykazują aktywność rozkładającą kalus. Określono podstawowe informacje na temat ich względnych rozmiarów molekularnych, ich pi. Nie można było jednak zająć się konwencjonalnymi badaniami kinetycznymi enzymów, ponieważ naturalnym substratem wykorzystywanym w tych eksperymentach in vitro była złożona mieszanina polimerów, nierozpuszczalna w wodzie. Zwiększona aktywność enzymu P2 w obecności soli 800 mmol 1-1 może mieć znaczenie dla przetrwania mikroorganizmu na ludzkiej skórze, która ma zmieniające się stężenie soli w zależności od aktywności gruczołu eksrynowego określonej przez szybkość wysiłku osoby i temperatury otoczenia. Mechanizm (- y) działania chlorku sodu nie został (- y) omówiony (- e). Sugeruje się wstępnie, że chlorek sodu może wpływać albo na trzeciorzędową strukturę enzymu i substratu, albo na oba te czynniki, w celu poprawy dostępu miejsc aktywnych enzymów do określonych miejsc rozszczepiania substratu.
najprostszym wyjaśnieniem obserwowanych wyników jest to, że w supernatancie hodowlanym K. sedentarius istnieją dwa enzymy rozkładające kalus, proteazy serynowe, które również rozpuszczają ludzką keratynę obecną w kalusie. Możliwe, że K. sedentarius wytwarza jedną proteazę, kodowaną przez jeden gen, a ta aktywność autokatalityczna lub inna proteaza wytwarza dwa enzymy o różnej masie cząsteczkowej. Alternatywnie istnieją dwa geny kodujące dwa niezależne i blisko spokrewnione enzymy. Ta ostatnia hipoteza jest poparta poprzednim badaniem (Holland et al. 1992). Próbki z ciągłej hodowli K. sedentarius w stanie stacjonarnym z różnymi szybkościami rozcieńczania, oznaczone na stronie i pokryte kazeiną, wykazały dwa enzymy, jeden konstytutywny, a drugi wykrywany w wysokich stężeniach przy niskich szybkościach rozcieńczania. Co ważne, przy szybkości rozcieńczania zbliżonej do µmax nie został wykryty. Oznaczanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej polipeptydów P1 (21 reszt) i P2 (15 reszt) wykazało, że są one zupełnie inne. Wynik ten, wzięty razem z informacjami z eksperymentu z ciągłą hodowlą, sugerowałby, że enzymy są niezależnie kodowane.
wyniki tych badań wzmocniły hipotezę, że specyficzne proteazy K. sedentarius mogą odpowiadać za degradację kalusa charakterystyczną dla keratolizy z pestką. Dotychczasowe dowody sugerują również, że dwie proteazy są zaangażowane i że są one aktywne w miejscu pH skóry, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Interpretacja wyników uzyskanych z doświadczeń in vitro do środowiska in vivo może być kwestionowana, mimo że jako substrat użyto ludzkiego kalusa. Najlepiej, biopsje ludzkiej skóry powinny być wykonane w tym obszarach skóry normalnej i pestki. Obecność i lokalizacja proteaz lub ich brak można następnie określić za pomocą technik histologicznych z użyciem przeciwciał monoklonalnych jako sond dla proteaz i K. sedentarius. Nie można jednak uzyskać zgody etycznej w przypadku biopsji z wymaganego miejsca, miejsca nośnego stopy, od reprezentatywnej liczby osób. Zaangażowanie K. sedentarius w rogowacenie dziurawca przez mechanizm produkcji proteaz degradujących keratynę nie zostało formalnie udowodnione. Nie ma jednak dowodów obalających hipotezy, a jej wiarygodność została wzmocniona prezentowanymi tu wynikami. W warunkach in vitro przedstawiono silne dowody wskazujące na obecność K. sedentarius i jego zewnątrzkomórkowych enzymów rozkładających kalus w stanie keratolizy. Przy prawidłowym pH skóry i nawilżaniu powierzchni produkcja i aktywność tych enzymów będzie niska, a P1 będzie bardziej aktywny. W warunkach środowiskowych okluzji i przy słabej higeinie pH skóry przesuwa się do i nieco powyżej neutralności. Warunki te sprzyjają P2. Oba enzymy są najprawdopodobniej enzymami oczyszczającymi, dzięki czemu K. sedentarius otrzymuje źródła węgla i azotu, małe peptydy, zamknięte w rezydentnym i nierozpuszczalnym polimerze złożonym, keratynę. Obecnie nie jest znana regulacja produkcji tych enzymów, podobnie jak ich względny udział w degradacji kalusa in vivo. Oprócz implikacji klinicznych, proteazy keratynolityczne mają znaczną wartość dla sektora komercyjnego, ponieważ są przydatne w wielu procesach przemysłowych, w tym degradacji odpadów keratyny z przemysłu drobiarskiego i skórzanego (Shih 1993; Onifade et al. 1998). Wysoka aktywność keratynolityczna K. proteazy sedentarius w stosunkowo niskich temperaturach i pH, w porównaniu z wieloma innymi proteazami, stanowią potencjalne zastosowanie tych enzymów w przemyśle biotechnologicznym.
