utrzymanie i zapasy danio pręgowanego: danio pręgowanego (Danio rerio) hodowano i inscenizowano zgodnie z ustalonymi protokołami 30.Używane linie transgeniczne to Tg(KDR-l:ras-mCherry)s91631, TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, TG(fli1:myr-EGFP)ncv233, TG(fli1:myr-mCherry)ncv134, TG (fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, TG (UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC (pdgfrb: GFP) ncv2236 i TG (KDRL: EGFP)s84337. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w RIKEN Kobe Branch (IACUC).
plazmidy i oligonukleotydy: danio pręgowanego marcksl1a, Marcksl1b i fscn1a sklonowano metodą PCR z cDNA 1 zarodków dpf przy użyciu zestawu do klonowania NEB® PCR. Wszystkie konstrukty ekspresyjne użyte w tym badaniu zostały wygenerowane przez klonowanie Gateway® i / lub klonowanie In-Fusion® przy użyciu plazmidów z Tol2Kit38. Plazmidy ze zmutowanymi Marcksl1a i Marcksl1b generowano przy użyciu Q5® Site-Directed mutagenesis kit (NEB). wektory zawierające shRNA zostały skonstruowane przez ligację sekwencji shRNA między miejscami EcoRI i PmeI poniżej promotora U6 zmodyfikowanego wektora pEGFP-U639 (dar Zuoshanga Xu, Addgene plasmid #19799). Sekwencja docelowa dla ludzkiego MARCKSL1 to 5′-GTGTGAACGGAACAGATGATG-3′. Kodowana Sekwencja shRNA 5 ’- GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ’ została zaprojektowana jako niedopasowana Sekwencja (podkreślona) MARCKSL1 shRNA. Wektory zawierające myszy Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) i Marcksl1-S120D/T148D/T183d (Marcksl1-DDD) subklonowane do pEGFP-N1 (Clontech)10 były podarunkami Eleanor T. Coffey (Uniwersytet w Turku). Szczegółowe informacje dotyczące plazmidów i starterów stosowanych w tym badaniu można znaleźć odpowiednio w dodatkowych tabelach 1 i 2.
izolacja RNA i synteza cDNA: Całkowity RNA wyizolowano za pomocą odczynnika TRI (epigenetyka) i zestawu Mikroprep RNA Direct-zolTM (Zymo Research), a cDNA zsyntetyzowano za pomocą systemu syntezy pierwszej nici SuperScript III® (Invitrogen) zgodnie z protokołami producenta.
mozaikowa ekspresja konstruktów i transgenicznych linii danio pręgowanego: Konstrukcje ekspresyjne oparte na Tol2 (5-10 pg) wstrzyknięto do zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym z 50 pg transpozazy Tol2 mRNA transkrybowanej z NotI-linearyzowanego wektora pCS-TP (prezent od Koichi Kawakami, National Institute of Genetics, Japonia) przy użyciu zestawu Mmessage MMACHINE SP6 (Invitrogen). W celu uzyskania mozaikowej ekspresji transgenów, zarodki analizowano w 1 lub 2 dpf po wstrzyknięciu. W celu wytworzenia linii TG(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 i TG (fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26 wstrzyknięto zarodki DOROSŁYM i przebadano pod kątem ich pochodzenia.
generacja mutantów marcksl1a i marcksl1b: mutanty marcksl1a były generowane przez mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Jednoprzewodnikowy RNA (sgRNA) ukierunkowany na drugi ekson (dodatkowe rys. 4A) został wygenerowany przy użyciu protokołu niezależnego od klonowania40. Kompleks RNP Cas9 / sgRNA zmontowano tuż przed wstrzyknięciem i po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej 200 pg białka Cas9 (Invitrogen) i 100 PG sgRNA wstrzyknięto do jednokomórkowego Stadium TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(KDR-l:ras-mCherry)zarodka s916. mutanty marcksl1b powstawały w wyniku mutagenezy za pośrednictwem TALENA. TALEN skierował pierwszy ekson marcksl1b (rys. uzupełniająca 4b) został zaprojektowany przy użyciu Tal Effector nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) i zostały zmontowane metodą Złotej Bramy 41. Talen repeat variable di-residues (RVDS) klonowano do wektora Rciscript-GoldyTALEN (Addgene) i ograniczono mRNA dla każdego Talenu in vitro transkrybowano z Saci-linearyzowanych plazmidów ekspresyjnych przy użyciu mMESSAGE mmachine T3 kit (Invitrogen). One-cell stage Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:zarodki ras-mCherry) s916 zostały poddane mikroiniekcji z 200 pg RNA (po 100 PG każdego lewego i prawego mRNA TALENA). Założyciele F0 zostali zidentyfikowani przez outcrossing Talen lub CRISPR/Cas9 wstrzykniętych ryb dzikich ryb i przesiewanie potomstwa pod kątem mutacji w 2 dpf przy użyciu testu T7 endonukleazy I (NEB) (dla ryb wstrzykniętych TALEN) lub sekwencjonowanie Sanger (dla ryb wstrzykniętych CRISPR/Cas9). Krótko mówiąc, genomowe DNA wyizolowano z grup po pięć zarodków przy użyciu metody HotSHOT method42 i Amplifikowano odpowiednie regiony genomowe. Mutacje oceniano poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie oczyszczonych produktów PCR. Potomstwo F1 z dodatnim F0 zostało podniesione do wieku dorosłego, a heterozygotyczne nośniki mutacji zidentyfikowano poprzez obcinanie płetw i rutynową analizę PCR genotypowania przy użyciu tych samych starterów.
podczas badań przesiewowych zidentyfikowano sześć zmutowanych alleli w marcksl1a i pięć zmutowanych alleli w marcksl1b(dodatkowe rys. 13). Allel rk23 zawiera delecję 2-nt, która prowadzi do przesunięcia Ramki po aminokwasie 51 i przedwczesnego kodonu stop w aminokwasie 56 Po 5 aminokwasach missense(dodatkowe rys. 4a, c). Allel rk24 zawiera delecję 5-nt, która prowadzi do przesunięcia Ramki po aminokwasie 13 i przedwczesnego kodonu stop w aminokwasie 17 Po 4 aminokwasach missense(dodatkowe rys. 4b, d). Z tych powodów uznajemy marcksl1ark23 i marcksl1brk24 za allele zerowe i skupiamy nasze badania na analizach tych mutantów.
obrazowanie na żywo: zarodki montowano w 0,8% niskotopliwej agarozie (Bio-Rad) w pożywce E3 zawierającej 0,16 mg/mL Trikainy i 0,003% fenylotiomocznika. Konfokalne z-stosy pozyskano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1 wyposażonego w aparat fotograficzny Zyla 4,2 CMOS (Andor). Obrazy w jasnym polu uzyskano za pomocą mikroskopu Leica M205fa. Obrazy były przetwarzane przy użyciu Fidżi (NIH).
ablacja laserowa: Ablacje laserowe przeprowadzono przy użyciu lasera 405 nm (Andor) i modułu Frappa (Andor) zamontowanego na odwróconym mikroskopie konfokalnym Olympus Ix83/Yokogawa CSU-W1 z obiektywem immersji wodnej Olympus UPLSAPO 60x/na 1.2. Zastosowano trzy sekwencyjne ablacje laserowe o czasie przebywania 1000 µs każda przy 51% mocy lasera.
Mikroangiografia: Mikroangiografię wykonano w typie dzikim, marcksl1ark23, marcksl1brk24 i marcksl1ark23;zarodki marcksl1brk24. W sumie 2 i 3 zarodki dpf wstrzyknięto 1-2 nL dekstran tetrametylową rodaminą lub dekstranową fluoresceiną (MW = 2000 kDa, Invitrogen) w dawce 10 mg/mL i natychmiast zobrazowano. Konfokalne z-stosy zostały nabyte z obiektywem Olympus UPLSAPO 10×/NA 0,4. Aby pokryć cały zarodek, kilka regionów zostało zobrazowanych i zszytych za pomocą wtyczki Stitching w Fiji43.
przeszczep komórek: grupy 15-25 komórek dawców z marcksl1ark23; zmutowane zarodki marcksl1brk24 w TG (KDR-l:ras-mCherry)s916 Pobrano z losowej pozycji w blastodermie i przeszczepiono do bocznej strefy brzeżnej w blastodermie44 zarodków biorczych typu dzikiego przy 4,5-6 hpf. Ekstrakcję i przeszczepienie przeprowadzono za pomocą Mikrowyjektora olejowego CellTram® 4R (Eppendorf) z kapilarą ze szkła borokrzemianowego GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) wykonaną z poziomym ściągaczem mikropipetowym P-87 (Sutter Instrument Co.) i microforge MF-900 (Narishige) w celu uzyskania gładkiej końcówki o kształcie „łyżki”. Podczas transplantacji zarodki trzymane w płytkach Petriego pokrytych agarozą z buforem 0,5 X E2 . Przy 2 dpf do mikroangiografii i obrazowania wybrano zarodki z dodatnimi ISVs mCherry ’ ego. Łącznie przeprowadzono osiem niezależnych przeszczepów.
obróbka chemiczna: Latrunkulinę B (Merck Millipore) rozpuszczono w DMSO do 1 mg/ml i przechowywano w -20 °C. CK666 (SIGMA) rozpuszczono w DMSO do 50 mM i przechowywano w 4 °C. wszystkie związki rozcieńczono do pożądanego stężenia w buforze E3.
transfekcja, siRNA-mediated protein knockdown and shear stress experiment: HUVECs (Lonza, C-2519A) hodowano w pożywce EGM (Lonza) i stosowano do przejścia 4. W przypadku transfekcji plazmidów, komórki wysiewano w pożywce Opti-MEM (Gibco) w ilości 5,8 × 104 komórek/cm2 na pokrywkach pokrytych Poli-L-lizyną i żelatyną i transfekowano 2 µg plazmidu przy użyciu Lipofektaminy 3000 (ThermoFisher Scientific). Dwie godziny po transfekcji, podłoże Opti-MEM zmieniono na podłoże EGM bez antybiotyków. W przypadku transfekcji siRNA, HUVECs (7.9 × 104 komórki / cm2) transfekowano 20 nM siRNA przy użyciu odczynnika DharmaFECT1 (Dharmakon). Transfekcję powtórzono po 24 godzinach. komórki hodowano przez dodatkowe 24 godziny przed całkowitą ekstrakcją lub fiksacją RNA. ON-TARGETplus human marcksl1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) został użyty do powalenia MARCKSL1. Jako kontrolną transfekcję siRNA wykorzystano pulę Niekierowaną ON-TARGETplus (Dharmacon). Komórki utrwalono 4% PFA/PBS, przeniknięto 0,1% Triton X-100 i zabarwiono 14 µM DAPI do znakowania jąder, Alexa 568-falloidina (1:1000, ThermoFisher Scientific) do wizualizacji f-aktyny i przeciwciała anty-VE-cadherin (1:100, Cell Signalling), a następnie przeciwciała wtórnego anty-króliczego Alexa 488 (1: 1000, ThermoFisher Scientific) w celu oznaczania połączeń EC.
w przypadku eksperymentów ze stresem ścinającym, hpaec (Lonza) hodowano w temperaturze 1000-1500 komórek/mm2 na 1% naczyniu pokrytym żelatyną w pożywce EGM-2 (Lonza) i stosowano przed przejściem 9. Komórki były narażone na statyczne lub laminarne naprężenia ścinające przy 15 dyn / cm2 przez 0,5, 1 lub 6 godzin przy użyciu równoległego aparatu płytkowego45,46. Jedna strona komory przepływowej składała się z 1% płyty szklanej pokrytej żelatyną, na której spoczywały hodowane HPAECs, a druga strona składała się z płyty poliwęglanowej. Ich płaskie powierzchnie były oddalone od siebie o 200 µm uszczelką Teflonową. Komora była wyposażona w wejście i wyjście dla płynu, a wejście było połączone z górnym zbiornikiem za pomocą silikonowej rurki. Wyjście było otwarte do dolnego zbiornika. Przepływ był napędzany przez pompę rolkowo-rurową. Płyn (medium EGM-2) przeszedł z górnego zbiornika przez komorę przepływu do dolnego zbiornika. Natężenie przepływu monitorowano za pomocą ultradźwiękowego przepływomierza czasu tranzytu (HT107, Systemy Transoniczne) umieszczonego przy wejściu i kontrolowano je poprzez zmianę różnicy wysokości między górnym zbiornikiem a wyjściem komory przepływu. Intensywność naprężenia ścinającego (τ, dynes/cm2) działającego na warstwę EC obliczono za pomocą wzoru τ = 6µq/A2B, gdzie μ jest lepkością perfuzatu (poise), Q jest objętością przepływu (ml/S), A a i b są wymiarami przekroju drogi przepływu (cm). Po ekspozycji na stres ścinający wyizolowano całkowite RNA dla qPCR.
ilościowe PCR w czasie rzeczywistym: qPCR przeprowadzono stosując 1 µL cDNA, wygenerowanego ze 150 ng (HPAECs) lub 500 ng (HUVECs) całkowitego RNA, w mieszaninie reakcyjnej o pojemności 10 µL zawierającej 1x Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) i 400 nM starterów do przodu i do tyłu. Reakcje były prowadzone na instrumencie ABI Prism 7900HT w czworokącie. Dane analizowano za pomocą oprogramowania RQ Manager (Applied Biosystems) i obliczano względną ekspresję mRNA MARCKSL1 metodą 2−Δδct47 z wykorzystaniem GAPDH jako genu referencyjnego.
cała góra in situ: Hybrydyzację całego mount in situ przeprowadzono zgodnie ze standardowym protokółem48. Zarodki utrwalano w 4% PFA przy 24, 48 i 72 hpf i permeabilizowano 10 µg/mL proteinazy K. hybrydyzację prowadzono w buforze zawierającym 5% siarczanu dekstranu sodu (MW = 500 kDa) w 70 °C przez noc. Po przemywaniu surowym próbki blokowano 2% odczynnikiem blokującym (Roche) w buforze kwasu maleinowego i inkubowano przez noc z przeciwciałem przeciw digoksygeninie (DIG), sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (Roche, 1:5000) w temperaturze 4 °C. zarodki barwiono roztworem NBT/BCIP (Roche) w buforze barwiącym . Zarodki oczyszczono w 70% glicerolu przez noc i zobrazowano za pomocą mikroskopu Leica m205fa. Marcksl1a i marcksl1b o długości 1,2 kb zostały wygenerowane z plazmidów kodujących pełnowymiarowe cDNA przy użyciu zestawów MEGAscript SP6 lub T7 (Invitrogen).
jednokomórkowe sekwencjonowanie RNA: ECs wyizolowano z transgenicznych zarodków TG (KDRL: EGFP) S843. Sortowanie komórek przeprowadzono za pomocą FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). Zawiesina jednokomórkowa została załadowana do systemu Chromium 10x, a Biblioteki cDNA zostały skonstruowane przy użyciu Chromium Next GEM Single Cell 3 ’ GEM, Biblioteki i Gel Bead Kit v2 (10x Genomics) zgodnie z protokołem producenta. Biblioteka została zsekwencjonowana na sekwencerze Illumina HiSeq 1500 (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 został użyty w celu de-multipleksowania plików raw base call (BCL) generowanych przez sekwencery Illumina do plików FASTQ, wykonywania wyrównania, liczenia kodów kreskowych i liczenia UMI. Odczyty sekwencjonowania zostały zmapowane do zespołu genomu danio pręgowanego (GRCz11, Ensembl release 92). Dalsze analizy przeprowadzono przy użyciu pakietu Seurat package49 w oprogramowaniu R (https://www.r-project.org). Matryce ekspresyjne najpierw filtrowano, zachowując geny, które ulegają ekspresji w co najmniej 3 komórkach i komórki, które ulegają ekspresji co najmniej 200 genów do dalszej analizy. Komórki następnie filtrowano, wybierając komórki wykazujące niską zawartość mitochondriów (< 7%). Dane zostały następnie znormalizowane za pomocą funkcji NormalizedData, która normalizuje ekspresję genu dla każdej komórki przez całkowitą ekspresję.
kwantyfikacja średnicy naczynia krwionośnego:Live TG(fli1ep: Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transgeniczny dziki typ lub zmutowane zarodki marcksl1 zostały zobrazowane przy 50-52 hpf. Konfokalne z-stosy zostały nabyte wraz z obiektywem zanurzeniowym Olympus UPLSAPO 40×/NA1.25 z olejem silikonowym. Dla obliczeń średnicy DA i PCV wykonano 4-5 pomiarów między ISVs wzdłuż przedłużenia żółtka (ISVs nr 10-14). Dla średnicy ISV wykonano średnio 6 pomiarów wzdłuż każdego ISV (ISVs nr 10-14) między DA a DLAV. Pomiary wykonano przy użyciu Fidżi (NIH).
: Aby policzyć Numer WE, 52 zarodki HPF wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 lub marcksl1ark23;zarodki marcksl1brk24 w tła TG(KDR-l:ras-mCherry)s916 zostały utrwalone w 4% PFA i zabarwione 3 µM DAPI. Konfokalne z-stosy zostały nabyte wraz z obiektywem immersyjnym Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25 z olejem silikonowym. Jądra były liczone w każdym ISV (ISVs nr 9-22) między DA a DLAV. Do ilościowego oznaczania mitotycznych ECs w ISVs, wildtype lub marcksl1ark23; zarodków marcksl1brk24 w TG(fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495;Tg (kdr-l:tło ras-mCherry) s916 utrwalono w 4% PFA przy 30, 36 i 48 hpf, przeniknięto w 1% DMSO / 1% Triton X-100 i zabarwiono przeciwciałem przeciw fosfo H3 (1:250, Merck Millipore), a następnie przeciwciałem wtórnym przeciw Alexa 488 przeciw królikowi (1:1000, ThermoFisher Scientific) i 3 µM DAPI. Konfokalne z-stosy zostały nabyte wraz z obiektywem immersyjnym Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25 z olejem silikonowym. Komórki mitotyczne (PH3-dodatnie) liczono w ISVs po obu stronach zarodka (ISVs nr 9-22). ISV były wizualizowane przy użyciu fluorescencji mCherry. Wykryto tylko jedną komórkę PH3-dodatnią na ISV niezależnie od pozycji ISV. W trakcie liczenia rozważaliśmy EC w telofazie jako pojedynczą komórkę. Aby policzyć liczbę podziałów EC, wildtype lub marcksl1ark23; zarodki marcksl1brk24 w TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG (KDR-l:ras-mCherry)s916 zostały zobrazowane w zakresie od 24 do 48 hpf w odstępach 6 minut przy użyciu obiektywu zanurzeniowego Olympus UPLSAPO 30×/NA 1.05. Liczbę podziałów komórkowych w każdym ISV (ISVs nr 11-15) określono ilościowo.
oznaczanie ilościowe poziomów actomyosin w korze wierzchołkowej: Live TG (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Zarodki danio pręgowanego TG(fli1ep:EGFP-PLCΔ1PH)rk26 i TG(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; TG (KDR-l:ras-mCherry)s916 zostały zobrazowane przy 30-34 hpf przy użyciu obiektywu immersji wodnej Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2. Intensywność Lifeact lub Myl9b wzdłuż kory wierzchołkowej i w cytoplazmie mierzono za pomocą Fidżi. Obliczono stosunek średniej intensywności korowej do cytoplazmatycznej.
analiza kształtu komórek In vivo: oznakowanie pojedynczych komórek ECs w ISVs uzyskano przez ekspresję mozaikową fli1ep: plazmidu lynEGFP w typie dzikim, marcksl1brk24 lub marcksl1ark23;zmutowanych zarodków marcksl1brk24 lub fli1ep:marcksl1b-plazmid EGFP w zarodkach typu dzikiego. Przy 2 dpf wykonano mikroangiografię i zobrazowano naczynia za pomocą obiektywu zanurzeniowego Olympus UPLSAPO 60×/NA 1,2 z optycznymi płaszczyznami Z 0,25 µm. Analiza kształtu komórek ECs ISVs została przeprowadzona w sposób półautomatyczny przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ opracowanego w Pythonie, rozszerzającego metodę opisaną w ref. 50. Obrazy zostały najpierw Ostro przycięte, aby zmniejszyć wymagania dotyczące pamięci na dalszym etapie, a dodatkowe metadane (typ statku i identyfikator zarodka) zostały wypełnione. Oddzielny skrypt został następnie uruchomiony, aby projektować i rozpakowywać komórki z otoczenia naczynia na powierzchnię 2D. Krótko mówiąc, przycięte obrazy zostały najpierw obrócone w oparciu o Typ naczynia, aby dokładnie wyrównać oś naczynia z kierunkiem Z w stosie obrazów, a kanał fluorescencyjnej mozaiki komórkowej został wybrany do projekcji. Aby przezwyciężyć problemy z automatyczną segmentacją naczynia w kanale fluorescencyjnym puli krwi spowodowaną zmiennymi strukturami fluorescencyjnego tła i perfuzją dekstranu-rodaminy poza naczyniem, oś naczynia zidentyfikowano przez ręczne zdefiniowanie pozycji naczynia w przybliżeniu co 10 µm przez stos obrazów, a następnie wykonanie dopasowania i interpolacji splajnu Catmull-Rom. Dane zostały następnie przekształcone w celu prostowania osi statku w trzech wymiarach. Następnie zidentyfikowano położenie maksymalnego natężenia w kanale projekcyjnym wzdłuż promieni w odstępach 1° wokół osi statku. Informacje te zostały wykorzystane do projekcji natężenia fluorescencji na płaszczyźnie, gdzie osie są umieszczone wzdłuż osi statku i pozycji kątowej, i map odległość od osi statku w każdej pozycji na projektowanej płaszczyźnie. Komórka została zidentyfikowana na podstawie wyświetlanego obrazu za pomocą wbudowanej metody Intermodes ImageJ. Następnie obliczono długości łuku reprezentowane przez boki każdego piksela związanego z komórką (\(l = \ frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), gdzie r jest odległością między pikselem powiązanym z komórką a osią statku, A d jest bokiem piksela)i służy do generowania miar powierzchni komórki i proporcji.
analiza kształtu komórek in vitro: stałe Huvec zostały zobrazowane za pomocą obiektywu zanurzeniowego oleju silikonowego Olympus UPLSAPO 40×/NA 1,25. W sumie 10-20 zdjęć z każdego poślizgu okładki zostało pobranych do kwantyfikacji i przeanalizowanych w półautomatyczny sposób przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ. Wielokanałowe stosy z były maksymalnie wyświetlane, a kanał pokazujący znacznik GFP został zidentyfikowany na podstawie metadanych instrumentów. Wbudowana metoda progowania Otsu ImageJ została użyta do oddzielenia interesujących komórek od tła; powstałe obrazy binarne zostały oczyszczone przez usunięcie obszarów mniejszych niż 105 µm2 i regionów stykających się z granicą pola widzenia. Kolejny krok ręcznej interwencji umożliwił użytkownikowi opcjonalną modyfikację interesujących regionów komórek w oparciu o ten obraz binarny w celu oddzielenia błędnie połączonych komórek lub włączenia komórek, które zostały pominięte przez operację progowania. Skrypt następnie obliczył obszary i perymetry dla każdej komórki ROI. Ponadto dla każdej komórki obliczono „wskaźnik spikiness” w oparciu o stosunek obwodu komórki do obwodu odpowiedniego wypukłego kadłuba, a wartość współczynnika kształtu komórki obliczono jako stosunek głównych i mniejszych osi elipsy dopasowanej do wskaźnika ROI komórki.
Analiza blebbingu membranowego: wykresy dotyczące blebbingu membranowego zostały wygenerowane w półautomatyczny sposób przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ. Dla każdej zobrazowanej membrany obliczono stosunek długości konturu krawędzi membrany do euklidesowej odległości między punktami końcowymi krawędzi w każdym punkcie czasowym. Na podstawie uzyskanych szeregów czasowych gęstości widmowe mocy obliczono metodą Welcha51. Gęstość widmowa mocy była następnie uśredniana w oknie zainteresowania, definiowanym empirycznie jako charakterystyczny czas, w którym powstawały bleby (0,04-0,06 Hz); te uśrednione wartości porównywano między eksperymentalnymi (nadekspresja Marksl1b) a Warunkami kontrolnymi.
analiza dynamiki aktyny i miozyny II w pęcherzach: Wykresy odnoszące się do dynamiki aktyny lub miozyny w komórkach bąblujących zostały wygenerowane w półautomatyczny sposób przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ. Wielokanałowe poklatkowe stosy z były najpierw maksymalnie wyświetlane wzdłuż wymiaru Z. Następnie oprogramowanie automatycznie zidentyfikowało krawędź bleb między dwoma zdefiniowanymi przez użytkownika punktami kontrolnymi we wszystkich punktach czasowych, używając wbudowanej metody progowania Otsu ImageJ działającej na kanale Marksl1b-EGFP jako substratu dla etykietowania membranowego. Po etapie kontroli jakości użytkownika w celu zapewnienia dokładnej identyfikacji krawędzi bleb, profil intensywności kanału aktyny/miozyny wzdłuż krawędzi ekstrahowano w każdym punkcie czasowym i wykreślano z czasem w kymografie. W każdym punkcie czasowym ekstrakowano statystyki intensywności wraz z obszarem bleb, zdefiniowanym tutaj jako obszar projekcji z Ograniczony krawędzią i linią łączącą punkty po obu stronach bleb najdalej od wierzchołka bleb wzdłuż osi prostopadłej do linii łączącej punkty kontrolne zdefiniowane przez użytkownika, a średnie natężenie kanału aktyny/miozyny i obszar bleb były wykreślane w czasie.
Oznaczanie gęstości aktyny korowej i szerokości wiązki: Obrazy aktyny w HUVECs o wysokiej rozdzielczości uzyskano za pomocą obiektywu olejowego Plan-Apochromat 63x zamontowanego na mikroskopie konfokalnym Zeiss Lsm880 wyposażonym w detektor Airyscan i GaAsP. Około 3 µm kwadratowe obszary w każdej obserwacji zostały losowo wybrane i przycięte typowo 8 sekcji optycznych pokrywających siatkę korową z tych regionów. Rzutowane obrazy wzdłuż osi Z przyciętych stosów były generowane przez projekcję maksymalnej intensywności i poddawane następującej procedurze. Ponieważ włókna aktyny w obrazie były niejednoznaczne i niemożliwe było oszacowanie całej sieci, określiliśmy liczbę włókien aktyny w ograniczonych regionach jako gęstość siatki aktyny. Przeprowadzono to przez ustawienie linii skanowania wzdłuż osi X i Y co 4 piksele, a wartości pikseli wzdłuż każdej linii skanowania zostały poddane filtrowi Savitzky-Golay52 w celu obliczenia pochodnych pierwszego rzędu. Włókna aktyny zostały następnie zidentyfikowane przez znalezienie punktów zerowych, które są pikami intensywności linii skanowania. Liczenie pików zostało podzielone przez liczbę pikseli linii skanowania (szerokość lub wysokość obrazu), a gęstość filamentów nad obrazem została obliczona poprzez pobranie średniej z tych wartości.
aby obliczyć szerokość wiązki aktyny, linie centryczne wiązek aktyny zostały wygenerowane przez znalezienie zerowych punktów przecięcia pochodnych pierwszego rzędu obliczonych przez filtr Savitzky ’ ego-Golaya, a następnie zastosowanie algorytmu przerzedzania Hilditcha. Aby wyeliminować możliwość, że rozgałęzienia lub skrzyżowania włókien aktyny wpływają na pomiary, punkty rozgałęzień Znalezione w linii szkieletowej zostały wyeliminowane i segmentowane. Oś ortogonalną do całego segmentu wyznaczono przez otrzymanie wektora własnego, a natężenia fluorescencji próbkowano wzdłuż osi ortogonalnej biegnącej środkiem ciężkości segmentu za pomocą metody interpolacji Lanczos-5. Następnie średnicę żarnika wyznaczono na podstawie szerokości obszaru, który wykazywał większą lub równą połowie intensywności szczytowej w linii próbkowanej wzdłuż osi prostopadłej do całego segmentu.
statystyki: analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Rozmiary próbek nie były z góry określone, eksperymenty nie były randomizowane, a badacze nie byli zaślepieni do przydziału podczas eksperymentów i oceny wyników.
podsumowanie sprawozdań
więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu sprawozdań z badań przyrodniczych powiązanym z tym artykułem.
