niedobór dopełniacza C4 i Homozygotyczność HLA u pacjentów z częstymi Wewnątrzustnymi zakażeniami wirusem opryszczki Simplex typu 1

Streszczenie

trzech kolejnych pacjentów bez widocznego niedoboru odporności, którzy mieli częste nawroty wewnątrzustnej opryszczki simplex typu 1, rzadkie powikłanie zakażenia wirusem opryszczki simplex, stwierdzono całkowity niedobór IZOTYPU A lub B składnika dopełniacza C4 i być homozygotyczne dla badanych antygenów HLA. Połączenie homozygotyzmu HLA, które może prowadzić do upośledzonego rozpoznawania peptydów wirusowych przez komórki T, oraz niedoboru klasycznego szlaku dopełniacza, który może zagrażać neutralizacji wirusa, może predysponować do ciężkich i częstych zakażeń wirusem opryszczki pospolitej.

zachorowalność na zakażenie wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) wynika głównie ze zdolności HSV-1 do okresowej reaktywacji. Nawracająca opryszczka wargowa występuje u 15% -40% osób seropozytywnych . Osoby o obniżonej odporności rzadko mają zmiany wewnątrzustne. Spośród tych, którzy to robią, 52% doświadcza nawracających epizodów, często błędnie diagnozowanych jako aftowe zapalenie jamy ustnej lub rumień wielopostaciowy . Zmiany występują głównie na podniebieniu twardym i dziąsłach i mogą być skutecznie leczone długotrwałą profilaktyką przeciwwirusową.

skuteczność wczesnej odpowiedzi immunologicznej na wyraźne wystąpienie HSV – 1 jest bardzo zróżnicowana . Uważa się, że różnice w zakresie wytwarzania IFN-γ i specyficznych przeciwciał oraz nieprawidłowości w zakresie makrofagów lub funkcji komórek NK odpowiadają za różnice w częstości nawrotów i inwazyjności. HSV-1 posiada cząsteczkę dopełniacza, która prawie całkowicie blokuje alternatywny szlak dopełniacza i lokalnie aktywuje kompleks końcowy . Neutralizacja wirusa przez gospodarza prawdopodobnie zależy od indukowanej przez przeciwciała aktywacji szlaku klasycznego. Mimo to rola niedoborów dopełniacza w zakażeniach HSV otrzymała niewielką uwagę .

w ciągu 1 roku skierowano do nas 3 niepowiązanych pacjentów z małżeństw pozajęzykowych z powodu wyjątkowo aktywnej opryszczki wewnątrzustnej bez widocznego niedoboru odporności. Badaliśmy funkcje dopełniacza oraz geny czynnika dopełniacza C4 i HLA w tej małej grupie pacjentów rasy kaukaskiej. Wyniki wskazują na cechy immunologiczne, które mogą predysponować do aktywnego wewnątrzustnego zakażenia HSV-1.

U tych 3 pacjentek stwierdzono wewnątrzustne zakażenie HSV-1 z nawrotami >10 w skali roku, z nawracającymi pęcherzami opryszczkowymi głównie w podniebieniu twardym i dziąsłach. Częstość nawrotów utrzymywała się na stałym poziomie lub wzrastała z czasem (tabela 1).

krew pobierano do probówek zawierających heparynę, EDTA (10 mM) lub bez leków przeciwzakrzepowych. Próbki pobierano, gdy u pacjentów nie występowały objawy.

stężenia przeciwciał w surowicy przeciwko HSV-1 i HSV-2 oznaczano za pomocą komercyjnych pomiarów EIAs (HSV-1 ELISA IgG i HSV-2 ELISA IgG; Diagnostyka MRL). Próbki do PCR HSV, wykrywania antygenu i izolacji Pobrano z podstaw nowo nakłutych pęcherzyków wewnątrzustnych. Przeprowadzono izolację HSV i analizy PCR specyficzne dla danego typu . Próbki do wykrywania antygenu HSV przygotowano z wymazów metodą cytocentryfugacji . Szkiełka zostały zabarwione poliklonalnym HSV anty-króliczym IgG, a następnie znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny anty-króliczym IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Podobnie barwiono próbki tkanek osadzonych parafiną. Poziomy IgG, IgA i IgM oraz stężenia podklas IgG oznaczano ilościowo za pomocą nefelometrii z przeciwciałami poliklonalnymi z behringwerke.

próbki DNA genotypowano dla HLA-A,- B,-C i-DR za pomocą komercyjnych zestawów Pel-Freez (PF-ABC-SSP), jednego Lambda (ssp ABDR) lub INNO-Lipa (LiPA HLA-DRB1) o niskiej do pośredniej rozdzielczości alleli. Allotypy dopełniacza C4 oznaczano elektroforetycznie . Brak izotypu został potwierdzony przez izotypową amplifikację PCR genów C4A i C4B .

poziomy C3 I C4 w surowicy oznaczano ilościowo za pomocą nefelometrii z użyciem przeciwciał poliklonalnych i próbek referencyjnych z behringwerke. Klasyczną i alternatywną aktywność hemolitycznego dopełniacza wyznaczono za pomocą standaryzowanych testów hemolizy w żelu z miejsca wiązania.

aktywność jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) mierzono przez włączenie tymidyny po stymulacji PBMC fitohemaglutyniną, konkanawaliną A i mitogenem pokeweed i stwierdzono, że jest prawidłowa (dane nie pokazane) .

wyniki. Wszyscy pacjenci mieli >10 rocznych nawrotów HSV-1 (Tabela 1), które trwały 5-10 dni, ale były całkowicie tłumione przy długotrwałym doustnym leczeniu walacyklowirem. Leczenie objawowe rozpoczęło się po <24 godzinach. u pacjentów występowały liczne małe pęcherzyki (o średnicy 1-3 mm) w miejscach typowych dla wewnątrzustnego zakażenia HSV (tabela 1), ale nietypowych dla wewnątrzustnego rumienia wielopostaciowego lub aftowego zapalenia jamy ustnej. Pacjenci 1. i 3. często objawiali się jednocześnie typową opryszczką wargową (tabela 1). Zakażenie HSV-1 stało się częstsze w czasie ciąży u pacjentki 1 i w okresie dojrzewania u pacjentki 3. Oba miały również objawy podrażnienia opon mózgowo-rdzeniowych ze sztywnością karku i bóle mięśniowe, światłowstręt i obezwładniający ból głowy w tym samym czasie, co zmiany opryszczkowe. Nie wykryto zwiększonego poziomu białka ani pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym, a wynik testu PCR na obecność HSV w płynie mózgowo-rdzeniowym był ujemny u pacjenta 1. U pacjentów 1. i 3. występowały częste zakażenia górnych dróg oddechowych, a u pacjentów 1. nawracające zapalenie zatok.

u pacjentów nie stwierdzono cytopenii ani przeciwciał przeciwko wirusowi HIV, wirusowi zapalenia wątroby typu B lub wirusowi zapalenia wątroby typu C. Wyniki badań wirusologicznych i immunologicznych przedstawiono w tabelach 1 i 2. Wszyscy pacjenci byli seropozytywni na HSV-1. Rozpoznanie histologiczne dla pacjenta 2 oparto na typowej morfologii blistra HSV i potwierdzono immunostawieniem swoistym dla HSV. Wszyscy mieli trwające wewnątrzustne zakażenia HSV-1 (Tabela 1) i zmniejszoną aktywność hemolityczną klasycznego szlaku dopełniacza oraz poziom C4 w surowicy (tabela 1). Fenotypowanie C4 wykazało całkowity brak białka C4A (1 pacjent) lub C4B (2 pacjentki). U pacjentów stwierdzono homozygotyzm alleli klasy I I II HLA(tabela 2). Pacjent 2, homozygotyczny dla A1, B8, DR3, miał niski poziom IgA w surowicy (0,47 g / L).

dyskusja. W naszej wyselekcjonowanej grupie 3 pacjentów, wszyscy mieli wyjątkowo aktywne wewnątrzustne zakażenia HSV-1, byli homozygotyczni dla swoich głównych haplotypów kompleksu zgodności histologicznej (MHC) i mieli całkowity brak białka C4A lub C4B klasycznego szlaku dopełniacza (tabela 2) . Pacjenci mają zatem połączenie subtelnych zaburzeń w białkach MHC, które mogą zagrozić obronie immunologicznej przed zaostrzeniem HSV-1 w jamie ustnej gardła.

komórki T CD8+ z ograniczeniami klasy i są uważane za odpowiedzialne za usuwanie HSV. Zmienna szybkość zrzucania i nawrotów oraz zmienność skuteczności wczesnej odpowiedzi immunologicznej jest wynikiem kompleksowej interakcji między cząsteczkami odpornościowymi HSV a odpowiedzią immunologiczną pacjenta . Jest prawdopodobne, że oprócz komórek T, szybko działające ramiona odpowiedzi immunologicznej przyczyniają się do tego wczesnego etapu obrony.

NK, jednojądrzaste i CD4+ komórki T, immunoglobuliny, czynniki dopełniacza i głównie cytokiny typu Th1 znajdują się we wczesnych zmianach HSV. Pierwszymi limfocytami, które migrują do zmian HSV są komórki T CD4+ i komórki NK, odpowiedzialne za miejscowo zwiększoną produkcję cytokin. Produkty loci MHC klasy i HLA-a i-B prezentują peptydy do cytotoksycznych komórek T I NK, a te loci klasy II do komórek T CD4+. HSV – 1 może zakłócać prezentację antygenu przez cząsteczki MHC klasy I I II i wpływać na rozpoznawanie komórek T CD8+ i CD4+. Jak sugerowano w innych infekcjach wirusowych, ekspresja peptydów wirusowych do cytotoksycznych limfocytów T CD8+ na początku nawrotu może być hamowana przez homozygotyczność HLA, prawdopodobnie poprzez zmniejszoną zmienność repertuaru antygenu HLA u pacjentów, na przykład na komórkach nabłonka śluzówki. Ostatecznie, efekty produkcji cytokin przezwyciężą hamowanie ekspresji HLA klasy I przez HSV, umożliwiając komórkom T CD8+ oczyszczenie komórek zakażonych wirusem. Homozygotyzm MHC jest związany z przyspieszoną progresją choroby w zakażeniach wirusowych . Jest to, według naszej wiedzy, pierwsze badanie opisujące związek między homozygotycznością HLA a objawowymi nawrotami HSV.

zarówno haplotypy MHC zawierające B8,DR3 i B35,Cw4 były zaangażowane w nawracającą chorobę HSV i sugerowano, że prowadzą do agresywnej choroby wywoływanej przez wirusy otoczkowe . Haplotypy zawierające antygeny A3,B35, A1,B8 i B15 występują w postaci homozygotów w populacji Fińskiej z częstością odpowiednio 0,8%, 0,3% i 2%. Typowe dla haplotypów pacjentów są delecje C4.

białko C4 ma 2 izotypy, C4A i C4B, których geny są kodowane w regionie MHC klasy III. Po zakłóceniu ich wewnętrznych wiązań tiolestrowych, białka C4A i C4B wiążą się kowalencyjnie z grupami aminowymi lub hydroksylowymi na cząsteczkach docelowych i działają jako podjednostki w klasycznej drodze konwertazy C3, c4b2a. C4 ma złożony polimorfizm strukturalny z rozpoznanymi alotypami białka >40. Niedobór C4 jest spowodowany delecjami segmentowymi, duplikacjami, konwersjami genów lub mutacjami punktowymi, w wyniku których powstają allele „null” (Q0). Występują one z dużą częstotliwością. Około 35% osób wszystkich ras nie posiada 1 z 4 alleli C4A lub C4B . Całkowite niedobory C4A i C4B, czyli 2 zerowe allele w odpowiednich loci genu C4A lub C4B, występują odpowiednio U 3% i 8% populacji Fińskiej .

częstość występowania opryszczki wewnątrzustnej jest nieznana. Zachowawczo oceniamy ją na <0,5%. W populacji Fińskiej częstość występowania homozygotyzmu HLA dla 9 najczęstszych haplotypów wynosi 3%, a dla całkowitego niedoboru C4A lub C4B 11%. Częstość występowania wszystkich tych kombinacji wynosiłaby zatem 1.65 na 100 000 osób, ale niedobory HLA i C4 nie są niezależne, gdy są ze sobą powiązane. Prawdopodobieństwo, że 3 kolejnych pacjentów z opryszczką wewnątrzustną będzie mieć te połączone jest minimalne. Na przykład, wśród 10 000 pacjentów hospitalizowanych z rzędu, prawdopodobieństwo znalezienia 3 pacjentów zgodnych, zgodnie z rozkładem Poissona, wyniosłoby 0,00064.

specyficzne przeciwciała i dopełniacz działają w porozumieniu, aby bezpośrednio neutralizować i opsonizować HSV oraz zwiększać cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. Aby uniknąć tych szybko działających ramion odporności, HSV – 1 koduje specyficzne białka. Po pierwsze, białka wiążące IgFc hamują aktywność IgG i umożliwiają wirusowi i zainfekowanym komórkom ucieczkę przed atakiem przeciwciał . Po drugie, glikoproteina przezbłonowa HSV-1 GC-1 chroni wirion i komórki zakażone HSV przed neutralizacją dopełniacza, ułatwiając w ten sposób miejscowe rozprzestrzenianie się . Chociaż wirus wydaje się być zdolny do radzenia sobie z alternatywnym szlakiem dopełniacza, oporność gospodarza wydaje się zależeć od klasycznego szlaku. Niedobory w nim, lub w przeciwciałach aktywujących go, mogą mieć głęboki wpływ na lokalne rozprzestrzenianie się i częstość nawrotów HSV-1.

podsumowując, nasze badania sugerują, że niedobór któregokolwiek z 2 białek C4 może być ważny w określaniu podatności na przewlekle aktywną chorobę HSV-1. Ponadto homozygotyczność HLA wydaje się być również czynnikiem podatności. Podatność na wyjątkowo ciężką infekcję wirusową może być zatem podyktowana kombinacją subtelnych wad w wielu ramionach układu odpornościowego.