technologie fluorescencji były przez wiele lat preferowaną metodą wykrywania, wykrywania analitycznego, diagnostyki medycznej, biotechnologii, obrazowania i ekspresji genów. Fluorescencja staje się niezbędna do badania procesów molekularnych o wysokiej specyficzności i czułości poprzez różnorodne procesy biologiczne. Istotnym problemem w praktycznych zastosowaniach fluorescencyjnych jest pozorna Nieliniowość intensywności fluorescencji wynikająca z efektów wewnętrznego filtra, rozpraszania próbki i absorpcji wewnętrznych składników próbek biologicznych. Absorpcja próbki może prowadzić do podstawowego efektu filtra wewnętrznego (efekt filtra wewnętrznego typu I) i jest pierwszym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. Jest to stosunkowo prosty czynnik, który można kontrolować w każdym eksperymencie fluorescencyjnym. Jednak wiele wcześniejszych podejść podawało tylko przybliżone eksperymentalne metody korygowania odchylenia od oczekiwanych wyników. W tej części omawiamy pochodzenie pierwotnego efektu wewnętrznego filtra i przedstawiamy uniwersalne podejście do korygowania sygnału intensywności fluorescencji w pełnym zakresie absorpcji. Co ważne, przedstawiamy bezpośrednie eksperymentalne wyniki działania korekcji. Rozważa się problemy wynikające z różnych absorpcji w całym spektrum absorpcji dla wszystkich fluorophores. Używamy Rhodamine 800 i zademonstrujemy, jak prawidłowo skorygować widma wzbudzenia w szerokim zakresie długości fal. Drugi to efekt obojętnego absorbera, który tłumi intensywność wiązki wzbudzenia podczas podróży przez kuwetę, co prowadzi do znacznego odchylenia obserwowanych wyników. Jako przykład przedstawiamy hartowanie fluorescencyjne analogu tryptofanu nata przez akrylamid i pokazujemy, jak prawidłowo skorygowane wyniki porównują się do początkowych błędnych wyników. Procedura jest ogólna i ma zastosowanie do wielu innych zastosowań, takich jak wyznaczanie wydajności kwantowej, absorpcja tkanek/krwi lub absorpcja akceptora w eksperymentach FRET.
