ocena zastosowania testu stosunku Ka/Ks do alternatywnie splicowanych eksonów

Streszczenie

podsumowanie: niedawno zaproponowano i z powodzeniem zastosowano test stosunku Ka/Ks, który ocenia potencjał kodujący białka regionów genomowych w oparciu o ich niezwiązane z synonimicznymi współczynnikami rozbieżności, w adnotacjach genomu eukariotów. Systematycznie przeprowadzaliśmy test stosunku Ka / Ks na potwierdzonych transkrypcją 925 egzonach w ludzkim genomie, które opisujemy w tym manuskrypcie. Odkryliśmy, że 22,3% ewolucyjnie konserwowanych alternatywnie splicowanych egzonów nie może przejść testu stosunku Ka/Ks, w porównaniu z 9,8% dla egzonów konstytutywnych. Wskaźnik fałszywie ujemny był najwyższy (85,7%) dla eksonów z niską częstotliwością włączenia transkryptu. Analizy alternatywnie splicowanych eksonów wspieranych przez pełnowymiarowe sekwencje mRNA dały podobne wyniki, a prawie połowa egzonów biorących udział w alternatywnych zdarzeniach splicingu przodków nie mogła przejść tego testu. Nasza analiza sugeruje przyszły kierunek włączenia opartych na genomice porównawczych alternatywnych prognoz splicingu z testem stosunku Ka / Ks u wyższych eukariotów z rozległym alternatywnym splicingiem RNA.

Contact:[email protected]

1 Wprowadzenie

genomika porównawcza dostarczyła potężnych narzędzi do adnotacji genomów eukariotycznych (Kellis et al., 2003). W pionierskim badaniu Nekrutenko et al. (2002) zaproponował „Test stosunku Ka/Ks” w celu oceny potencjału kodującego białko przewidywanych eksonów. Test ten opiera się na założeniu, że większość regionów kodujących białka w ludzkim genomie jest poddawana silnej selekcji oczyszczającej podczas ewolucji. W rezultacie ich wskaźniki rozbieżności synonimicznej (Ks) znacznie przewyższają wskaźniki rozbieżności niezwiązanej (Ka), dając stosunek Ka/Ks znacznie mniejszy niż jeden w porównaniach sekwencji ortologicznych człowiek-mysz. Na próbie 1244 eksonów z 153 genów kodujących białko, test stosunku Ka / Ks dał 8% fałszywie ujemny wskaźnik i <5% fałszywie dodatni wskaźnik dla eksonów wewnętrznych, dokładność, która była lepsza niż większość narzędzi do przewidywania genów(Nekrutenko et al., 2002). Od czasu jego wprowadzenia test stosunku Ka / Ks był szeroko i z powodzeniem stosowany do poprawy adnotacji genomów ludzkich i innych ssaków(Miller et al., 2004; Nekrutenko, 2004; Nekrutenko et al., 2003b; Zhang and Gerstein, 2004).

jedno z pojawiających się pytań dotyczących testu stosunku Ka / Ks dotyczy alternatywnie splicowanych eksonów w genomach eukariotycznych. Ostatnie badania ekspresji sekwencji i danych mikromacierzy wykazały, że alternatywne splicing jest powszechnym mechanizmem regulacji genów u wyższych eukariotów (Lareau et al., 2004; Modrek i Lee, 2002). Do trzech czwartych ludzkich genów kodujących poddaje się alternatywnemu splicingowi (Johnson et al., 2003). Istnieje obfite dowody sugerujące, że alternatywne splicing jest związany ze złagodzeniem presji selekcji podczas ewolucji(Boue et al., 2003). Na przykład obserwuje się, że alternatywne splicing wiąże się z przyspieszonym tempem tworzenia i utraty egzonu (Modrek and Lee, 2003), nowymi powstawaniem egzonów z elementów Alu (Sorek et al., 2002), tolerancja kodonów przedwczesnego zakończenia (Lewis et al., 2003; Xing and Lee, 2004) i tak dalej. Iida i Akashi (2000) badali wzory dywergencji sekwencji 110 alternatywnie splicowanych genów kodujących białka z ludzi i Drosophila i odkryli, że alternatywnie splicowane regiony tych genów miały wyższe wartości Ka/Ks w porównaniu z regionami konstytutywnymi. Odnotowano również inne przykłady podwyższonego Ka / Ks w egzonach o zmiennym przebiegu (Filip i Mundy, 2004; Hurst i PAL, 2001). Obserwacje te budzą wątpliwości co do rozbieżności między testem stosunku Ka/Ks w egzonach z alternatywnie splatanych.

2 metody

zidentyfikowaliśmy alternatywnie splecione eksony, dopasowując sekwencje ekspresji ludzkiej do ludzkiego genomu (Modrek et al., 2001). Aby obliczyć stopień alternatywnego splicingu dla każdego alternatywnie splicowanego egzonu, użyliśmy standardowej metryki alternatywnego splicingu-poziomu inkluzji egzonu, zdefiniowanego jako liczba est, które zawierały Egzon, podzielona przez całkowitą liczbę est, które zawierały lub pomijały ten Egzon. Exony podzielono na trzy klasy w zależności od ich poziomów inkluzji: dur-form (>2/3), medium-form (między 1/3 a 2/3) i minor-form (<1/3).

zidentyfikowaliśmy sekwencję egzonów ortologicznych dla każdego egzonu ludzkiego w sekwencji genomowej ortologu myszy, jak wcześniej opisano (Modrek and Lee, 2003). Dla każdej pary sekwencji egzonów ortologicznych człowiek-mysz wykonaliśmy test stosunku Ka / Ks zgodnie z protokołem Nekrutenko et al. (2003a). Krótko mówiąc, ortologiczne sekwencje egzonów z ludzi i myszy zostały przetłumaczone, a następnie wyrównane za pomocą CLUSTALW Thompson et al., 1994 w parametrach domyślnych. To wyrównanie białka zostało użyte do wytworzenia wyrównania odpowiednich sekwencji nukleotydowych, a luki w wyrównaniu zostały przycięte. Oszacowaliśmy liczbę synonimicznych i nie-synonimicznych substytucji / stron za pomocą szacunków Yang-Nielsen z programu yn00 pakietu PAML (PAML 3.14) (Yang, 1997). Zbudowaliśmy tabelę awaryjną 2 × 2, wykorzystując liczby zmienionych i niezmienionych stron synonimicznych/nie synonimicznych, i przetestowaliśmy, czy stosunek Ka/Ks był znacząco <1, korzystając z dokładnego testu Fishera. Zdefiniowaliśmy Egzon jako przejście testu stosunku Ka / Ks, jeśli jego Ka/Ks było znacząco <1 na poziomie P < 0,05.

3 Wyniki i dyskusja

zebraliśmy listę 925 ludzkich alternatywnie splecionych eksonów, które zostały zachowane między genomami ludzkim i mysim, w oparciu o analizy sekwencji wyrażonych przez człowieka (Modrek et al., 2001). Sporządziliśmy również listę 10 996 egzonów konstytutywnych człowieka jako kontroli. Wszystkie te egzony były egzonami wewnętrznymi flankowanymi intronami na obu końcach. Przeprowadziliśmy testy współczynnika Ka/Ks na tych eksonach zgodnie z protokołem (Nekrutenko et al., 2003a) (patrz sekcja Metody). Z egzonów konstytucyjnych 9.8% nie zdało testu stosunku Ka / Ks, stosunek podobny do tego, co zostało zgłoszone przez wstępne badanie (8%) (Nekrutenko et al., 2002) (Tabela 1). W przeciwieństwie do tego, 22,3% badanych alternatywnie splicowanych egzonów nie mogło przejść testu stosunku Ka/Ks, co było ponad 2-krotnym wzrostem w porównaniu z egzonami konstytutywnymi. Ponieważ alternatywnie splecione egzony z różnymi poziomami inkluzji egzonów (patrz definicje w sekcji Metody) wykazywały różne wzorce dywergencji ewolucyjnej (Modrek and Lee, 2003; Pan et al., 2004, podzieliliśmy 925 alternatywnie splecionych egzonów na trzy klasy w oparciu o ich poziomy inkluzji egzonów(patrz sekcja Metody). Ułamek eksonów, który nie przeszedł testu, wynosił 16,0% dla eksonów głównych i wzrósł do 85,7% dla eksonów alternatywnych mniejszych (uwzględnionych w transkryptach <1/3). Ponieważ alternatywnie splecione egzony były średnio krótsze, podzieliliśmy również egzony na podstawie ich rozmiarów (rys. 1). Zarówno w egzonach konstytutywnych, jak i alternatywnie splatanych frakcje, które nie przeszły testu, były wyższe dla krótszych egzonów, zgodnie z oryginalnym badaniem Nekrutenko et al., 2002. Jednakże frakcja była konsekwentnie wyższa w egzonach alternatywnie splicowanych po kontrolowaniu wielkości egzonów (np. 5,4% dla egzonów konstytutywnych i 16,6% dla egzonów alternatywnie splicowanych między 101 A 150 nt; Fig. 1). Podobne wyniki przyniosły analizy egzonów mysich z alternatywnie splecionymi egzonami w porównaniu mysz-człowiek (dane nie zostały przedstawione).

nasz wynik wskazuje, że znacznie wyższa frakcja alternatywnie splecionych egzonów w ludzkim genomie nie może przejść testu stosunku Ka/Ks. Nie przekłada się to jednak od razu na zwiększoną fałszywie ujemną stopę testu stosunku Ka/Ks w eksonach z alternatywnie splatanych, ponieważ możliwe są inne interpretacje. Czy te dane rzeczywiście sugerują, że znaczna liczba alternatywnie splicowanych egzonów obserwowanych w ludzkich sekwencjach EST nie reprezentuje rzeczywistych egzonów, ale rzeczywiście pochodzi z artefaktów w danych EST (np. rzadkie błędy spliceosomalne) (Modrek and Lee, 2002; Sorek and Safer, 2003)? Wyjaśnienie to wydaje się szczególnie prawdopodobne dla eksonów o mniejszej formie (które są obserwowane w niewielkim ułamku sekwencji EST). Aby przetestować tę możliwość, przeanalizowaliśmy podzbiór alternatywnie splecionych eksonów, które były wspierane przez sekwencje mRNA o Pełnej długości. Zaobserwowaliśmy podobne frakcje egzonów alternatywnie splicowanych, które nie przeszły testu stosunku Ka / Ks (Tabela 2). Dlatego fałszywe egzony pochodzące z artefaktów EST nie mogą wyjaśnić naszych danych. Czy alternatywnie splicowane egzony, które nie spełniają testu stosunku Ka / Ks, w dużej mierze reprezentują niefunkcjonalne formy splicingu? Aby odpowiedzieć na to pytanie, ograniczyliśmy naszą analizę do zestawu 120 eksonów, które były alternatywnie łączone zarówno w transkryptomach ludzkich, jak i mysich. Taki wzór „ancestral alternative splicing” został powszechnie przyjęty jako kryterium funkcjonalnych alternatywnych zdarzeń splicingu (Resch et al., 2004; Sorek et al., 2004a). W tych eksonach nawet wyższe 49,2% (w porównaniu z 22,3% wszystkich alternatywnie splecionych egzonów) nie mogło przejść testu stosunku Ka/Ks (Tabela 1), zgodnie z innym niedawnym badaniem dotyczącym takich eksonów (Ohler et al., 2005). Dlatego hipoteza dla niefunkcjonalnych form splicingu nie może również wyjaśnić naszych danych. Wreszcie, aby wykluczyć potencjalny wpływ Wysp CpG, obliczyliśmy częstotliwość CpG nad GpC w każdym eksonie i ograniczyliśmy naszą analizę do podzbioru alternatywnie splicowanych eksonów, których stosunek CPG / GpC wynosił <0,8 (Iida and Akashi, 2000). Z tych eksonów 20,8% nie mogło przejść tego testu, podobnie jak odsetek dla całego zestawu alternatywnie połączonych eksonów(Tabela 1). Chociaż w zasadzie zwiększony stosunek Ka / Ks może odzwierciedlać różne podstawowe mechanizmy, które nie są przedmiotem niniejszego manuskryptu, nasze analizy kontrolne wskazują, że duża część funkcjonalnych alternatywnych eksonów w ludzkim genomie nie spełnia testu stosunku Ka / Ks.

Egzony konstytutywne przewyższają w większości genów kodujących białka egzony alternatywnie splecione. Ponieważ w wielu organizmach pokrycie sekwencji transkrypcji (np. ESTs) jest nadal dość niskie, test stosunku Ka / Ks jest potężnym narzędziem do udoskonalania obliczeniowych prognoz struktury genów. Jednak większość genów kodujących białka ssaków jest alternatywnie splicowanych, a niewielka liczba alternatywnie splicowanych egzonów może mieć głęboki wpływ funkcjonalny i regulacyjny, jak ostatnio zilustrowano przez alternatywne splicing domeny C2A Piccolo (Garcia et al., 2004) i wiele innych. Nasza analiza sugeruje, że w organizmach z ekstensywnym alternatywnym splicingiem (np. Ssaki) lepiej jest połączyć test stosunku Ka/Ks z innymi wskaźnikami wskazującymi prawdopodobieństwo alternatywnego splicingu. Na szczęście genomika ewolucyjna rzuciła również światło na typowe cechy funkcjonalnych alternatywnie splicowanych eksonów, które zostały z powodzeniem wykorzystane w prognozach (Philipps et al., 2004; Sorek et al., 2004b; Yeo et al., 2005). Takie informacje mogą być zintegrowane z testem stosunku Ka / Ks w celu dokładniejszej oceny potencjału kodującego białka regionów genomowych.

autorzy dziękują Anton Nekrutenko za przeczytanie naszego manuskryptu i za pomocne komentarze. Praca ta była wspierana przez NIH Grant U54-RR021813, nagrodę dla nauczyciela-uczonego dla C. J. L. Od Fundacji Dreyfusa, dotacja DOE DE-FC02-02ER63421. Y. X. jest wspierany przez Ph. d. dissertation fellowship z UCLA.

konflikt interesów: brak danych.