Oczyszczanie i charakterystyka asparaginazy z nasion Phaseolus vulgaris

Streszczenie

L-asparaginaza z bakterii została zastosowana w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej. Celem pracy było oczyszczenie i scharakteryzowanie L-asparaginazy z nasion Phaseolus vulgaris zamiast ze źródeł mikrobiologicznych. L-asparaginazę oczyszczono do pozornej jednorodności. Enzym ma masę cząsteczkową 79 kDa. Oczyszczona asparaginaza wykazywała bardzo małą aktywność w stosunku do wielu analogów asparaginy i glutaminy. L-asparaginaza była wolna od aktywności glutaminazy. Parametry kinetyczne, Km i Vmax oczyszczonego enzymu, wynosiły odpowiednio 6,72 mM i 0,16 µM. Enzym miał optymalne pH na poziomie 8,0. Enzym wykazywał wysoką stabilność przy zasadowym pH (pH 7,5–9,0) po inkubacji do 24 godzin. L-asparaginaza miała taką samą optymalną temperaturę i stabilność termiczną w 37°C. K + był w stanie znacznie zwiększyć aktywność asparaginazy o 150% w porównaniu z innymi badanymi metalami. Podsumowując, L-asparaginaza nie wykazywała aktywności glutaminazy i dobrej stabilności w szerokim zakresie warunków fizjologicznych, a zatem mogła być stosowana jako potencjalny kandydat do leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej.

1. Wprowadzenie

l-asparaginaza (amidohydrolaza l-asparaginowa E. C. 3.5.1.1) jest stosowana w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej i chłoniaka nieziarniczego . Zastosowanie L-asparaginazy w terapii przeciwnowotworowej opiera się na jej zdolności do rozszczepiania l-asparaginy, aminokwasu niezbędnego do wzrostu limfoblastów, do amoniaku i kwasu L-asparaginowego w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym, ponieważ limfoblasty nie są w stanie wytworzyć endogennej L-asparaginy, co prowadzi do śmierci tych komórek . Większość komórek nowotworowych jest zależna od egzogennego źródła tego aminokwasu dla przeżycia. Jednak normalne komórki są w stanie syntetyzować l-asparaginę, a tym samym są mniej dotknięte jej szybkim wyczerpaniem z powodu leczenia tym enzymem. L-asparaginaza może być również stosowana w celu zmniejszenia powstawania akrylamidu w potrawach smażonych i gotowanych w piecu, zwłaszcza w chipsach ziemniaczanych . Powstawanie akrylamidu przypisywano reakcji wolnej asparaginy i cukrów redukujących . Wyczerpanie asparaginy przez asparaginazę zapobiegło tworzeniu się akrylamidu .

L-asparaginaza jest szeroko rozpowszechniona wśród roślin, zwierząt i mikroorganizmów . U roślin enzym ten został po raz pierwszy wykryty w rozwijających się nasionach Lupinus albus . Asparaginaza została również oczyszczona z testa dojrzewających nasion L. polyphyllus . Zidentyfikowano dwie formy enzymu. Forma niezależna od K+występuje u L. arboreus i L. polyphyllus, a forma zależna od K + występuje u Pisum sativum i kilku innych gatunków roślin strączkowych, w tym innych gatunków Lupinus . Praca z przeciwciałami przeciw niezależnej od K+postaci L. polyphyllus nie ujawniła reakcji krzyżowej ani z asparaginazą grochu, ani z wieloma odmianami Lupinusa zawierającymi enzym zależny od K+, co sugeruje, że dwie formy asparaginazy są immunologicznie różne .

doniesiono o zastosowaniu asparaginazy roślinnej w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej . Dlatego głównym celem pracy było oczyszczenie i scharakteryzowanie L-asparaginazy z nasion Phaseolus vulgaris wolnej od L-glutaminazy zamiast L-asparaginazy ze źródeł mikrobiologicznych, która jest stosowana jako przeciwnowotworowa i wywołuje skutki uboczne ze względu na swoją odpowiedź immunologiczną.

2. Materiał i metody

2.1. Materiały roślinne

dojrzałe nasiona z Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 zostały uzyskane z Centrum Badań Rolniczych w Kairze w Egipcie.

2.2. Oczyszczanie asparaginazy

2.2.1. Surowy ekstrakt

surowy ekstrakt asparaginazy otrzymano przez homogenizację 50 g nasion z Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 w 20 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0 zawierającym 10% glicerolu, 50 mM KCl, 12,5 mM β-merkaptoetanolu i 1 mM PMSF. Homogeniat wirowano w temperaturze 10 000 ×g, a supernatant oznaczono jako ekstrakt surowy. Surowy ekstrakt zatężono przez dializę w stosunku do stałej sacharozy.

2.2.2. Kolumna DEAE-Sepharose

zagęszczony surowy ekstrakt nanoszono na kolumnę DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm i.d.), która wcześniej była równoważona 20 mM buforem Tris-HCl, pH 8,0. Enzym eluowano przez różne stężenia KCl wytworzonego w tym samym buforze z szybkością przepływu 60 mL / h i zebrano frakcje 3 mL. Trzy piki białka eluowano z aktywnością asparaginazy zgodnie z kolejnością elucji (asparaginazy I, II I III).

2.2.3. Sephacryl S-200

asparaginazę i o najwyższej aktywności nanoszono na kolumnę Sephacryl S-200 (90 × 0.6 cm i.D.), który wcześniej był równoważony tym samym buforem przy prędkości przepływu 30 mL/h i zebrano frakcje 3 mL.

2.3. Test asparaginazy

aktywność L-asparaginazy mierzono zmodyfikowaną metodą Wriston . L-asparaginaza katalizuje l-asparaginę do kwasu L-asparaginowego i amoniaku, a ten ostatni reaguje z odczynnikiem Nesslera, tworząc pomarańczowy produkt. Mieszanina testowa enzymu składała się z 900 µL świeżo przygotowanej l-asparaginy (20 mM) w 50 mM buforze Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl i 100 µL surowego ekstraktu enzymu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut i reakcję zatrzymano przez dodanie 100 µL 15% kwasu trichlorooctowego. Mieszaninę reakcyjną odwirowywano w temperaturze 10 000 ×g przez 5 minut w temperaturze 4°c w celu usunięcia osadów. Amoniak uwolniony w supernatancie oznaczono techniką kolorymetryczną przez dodanie 100 µL odczynnika Nesslera do próbki zawierającej 100 µL supernatantu i 800 µL wody destylowanej. Zawartość próbki wirowano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a OD mierzono przy 425 nm. Amoniak wytworzony w reakcji oznaczono na podstawie krzywej wzorcowej otrzymanej z siarczanem amonu. Jedną jednostkę aktywności l-asparaginazy definiuje się jako ilość enzymu, która uwalnia 1 µmol amoniaku na minutę w temperaturze 37°C.

2.4. Oznaczanie białka

białko oznaczano ilościowo metodą Bradforda standardowo z albuminą surowicy bydlęcej.

2.5. Oznaczenie masy cząsteczkowej

natywną masę cząsteczkową oznaczono za pomocą Sephacrylu S-200. Kolumnę skalibrowano z użyciem cytochromu C (12 400), anhydrazy węglanowej (29 000), albuminy surowicy bydlęcej (67 000), dehydrogenazy alkoholowej (150 000) i β-amylazy (200 000). Dekstranowy błękit (2 000 000) został użyty do określenia objętości pustki (Vo). Masę cząsteczkową podjednostek oszacowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS . Do krzywej kalibracyjnej wykorzystano fosforylazę B denaturowaną SDS (94 000), albuminę surowicy bydlęcej (67 000), albuminę jajową (43 000), anhydrazę węglanową (30 000), inhibitor trypsyny sojowej (20 000) i α-laktoalbuminę (14 200).

2.6. Charakterystyka asparaginazy

2.6.1. Swoistość substratu

aktywność asparaginazy oznaczano za pomocą niektórych analogów L-asparaginy. Aktywność względną wyrażono jako procentowy stosunek aktywności enzymu oznaczony względem różnych analogów struktury L-asparaginy do aktywności enzymu z L-asparaginą.

2.6.2. Parametry kinetyczne

wartości stałych Michaelisa (Km) i prędkości maksymalnej (Vmax) oznaczono przy użyciu l-asparaginy jako substratu w zakresie 2-20 mM. parametry kinetyczne oznaczono na wykresie Lineweaver-Burk.

2.6.3. Wpływ pH

optymalne pH dla aktywności asparaginazy określono przez oznaczanie aktywności przy różnych wartościach pH. Stabilność pH testowano przez inkubację enzymu przy pH 5,0–9,0 przez 24 godziny w temperaturze 4°c przy braku substratu, a aktywność resztkową oznaczano w standardowych warunkach testowych.

2.6.4. Wpływ temperatury

optymalną temperaturę dla aktywności asparaginazy wyznaczono przez oznaczanie enzymu w różnych temperaturach. Stabilność cieplną mierzono przez inkubację samego enzymu w różnych temperaturach przez 1 godzinę. po obróbce cieplnej roztwór enzymu ochłodzono i oznaczono aktywność resztkową po dodaniu substratów.

2.6.5. Działanie jonów metali

wpływ różnych jonów metali na aktywność enzymu oznaczano przez wstępne inkubowanie samego enzymu 10 mM jonami metali przez 15 minut przed dodaniem substratu. Aktywność oznaczona przy braku jonów metali oceniono na 100%.

3. Wyniki i dyskusja

wyniki etapów oczyszczania asparaginazy z P. vulgaris podsumowano w tabeli 1. Profil elucyjny chromatografii na kolumnie DEAE-Sepharose (Fig. 1) wykazał trzy piki białek o aktywności asparaginazy. Szczyt o największej aktywności asparaginazy nanoszono na kolumnę Sephacryl S-200 (fig.2). L-asparaginazę i oczyszczono 21,7-krotnie o specyficznej aktywności 846 jednostek/mg białka. Wykazano, że asparaginaza I jest czysta po kolumnie Sephacryl S-200, jak oceniono za pomocą SDS-PAGE (ryc. 3). Masa cząsteczkowa asparaginazy I za pomocą procedur Sephacryl S-200 i SDS-PAGE dała wartość 79 kDa jako podjednostka monomeru. To odkrycie jest zgodne z masami molekularnymi asparaginaz z Vigna unguiculata (70 kDa) i Lupinus polyphyllus (75 kDa). Dla asparaginazy z liści grochu wykryto średnią masę cząsteczkową 58 kDa . Dla asparaginaz bakteryjnych Masa cząsteczkowa wahała się od 140 do 160 kDa z podjednostkami tetramerowymi . Dla Streptobacillus sp wykryto bardzo niską masę cząsteczkową wynoszącą 11,2 kDa. Asparaginaza KK2S4 .

Rysunek 1

typowy profil elucyjny dla chromatografii asparaginazy z P. vulgaris na kolumnie DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm i.d.) uprzednio zrównoważone buforem Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 przy szybkości przepływu 60 mL / h i frakcjach 3 mL.

Rysunek 2

Filtracja żelowa asparaginazy i z frakcji DEAE-Sepharose na kolumnie Sephacryl S-200 (90 × 1,6 cm i.d.). Kolumnę równoważono 20 mM buforem Tris-HCl, pH 8,0 przy natężeniu przepływu 30 mL / h i frakcjach 3 mL.

Rysunek 3

SDS-strona do oznaczania jednorodności i masy cząsteczkowej asparaginazy i z Phaseolus vulgaris. (1) markery białkowe; (2) Sephacryl S-200 asparaginase I.

specyficzność substratowa asparaginazy I została zbadana przy użyciu szeregu analogów asparaginy i glutaminy (Tabela 2). Aktywność z L-asparaginą została uznana za 100% aktywności. DL-asparagina wykazuje 30% aktywności enzymu, gdzie DL-asparagina składa się z 1 : 1 mieszanka racemiczna. Analogi D-asparaginy, kwasu L-asparaginowego i kwasu L-glutaminowego wykazywały bardzo małą aktywność wobec asparaginazy I. nie stwierdzono aktywności w obecności L-glutaminy. Dlatego asparaginaza i z P. vulgaris jest wolna od glutaminazy. Zanieczyszczenie asparaginazy aktywnością glutaminazy powodowało działania niepożądane w trakcie leczenia przeciwnowotworowego . Asparaginaza L. arboreus hydrolizowała tylko l-asparaginę i hydroksaminian DL-aspartylu . Asparaginaza V. unguiculata była specyficzna dla L-asparaginy, nie hydrolizowała D-asparaginy i nie była specyficzna dla L-glutaminy .

parametry kinetyczne, Km i Vmax oczyszczonego enzymu, wynosiły odpowiednio 6,72 mM asparaginy i 0,16 µM amoniaku / mL (Fig.4). Podobne wartości Km wynoszące 6,6 i 7,0 mM oznaczono dla asparaginaz odpowiednio dla L. arboreus i L. angustifolius . Asparaginaza z nasion Lupinus ma wysokie Km dla asparaginy (12,2 mM) . Niski Km (1.2 mM) oznaczono asparaginazę z V. unguiculata . Dla bakterii wartości Km Dla l-asparaginazy z Escherichia coli i Erwinia carotovora wynosiły odpowiednio 3,5 i 7,14 mM .

Rysunek 4

Wykres Lineweaver-Burk odnoszący się do prędkości asparaginazy I od P. vulgaris do różnych stężeń L-asparaginy.

Asparaginaza i wykazywała optymalne pH przy 8,0 (ryc. 5). Między pH 6,0 A 9,0 zachowało się ponad 50% jego aktywności. Chociaż maksymalna aktywność przy fizjologicznym pH jest jednym z warunków wstępnych L-asparaginazy dla aktywności przeciwnowotworowej, oczyszczony enzym byłby przydatny, ponieważ 80% aktywności enzymu zostało zatrzymane przy pH 7,5. Enzym wykazywał stabilność przy zasadowym pH (pH 7,5-9,0), ponieważ zachowywał 90% swojej pierwotnej aktywności po inkubacji do 24 godzin (Fig.6). Jednak optymalne pH L-asparaginaz z kilku roślin wynosiło od 8,0 do 8,5 . Większość l-asparaginaz pochodzących od bakterii wykazywała zasadowe pH optima (8,0–10).

Rysunek 5

pH asparaginazy i z P. vulgaris. Aktywność enzymu mierzono w różnych pH przy użyciu standardowej metody oznaczania, jak opisano wcześniej.

Rysunek 6

stabilność pH asparaginazy i z P. vulgaris przy innym pH po inkubacji przez 24 h w temperaturze 4°C.

stwierdzono, że Asparaginaza I ma optymalną temperaturę w 37°C (Rysunek 7). Odnotowano podobną optymalną temperaturę asparaginazy z V. unguiculata (40°C). Temperatura ta była również podobna do temperatury opisywanej dla Pseudomonas aeruginosa i pectobacterium carotovorum . Optymalna aktywność Streptobacillus Sp. asparaginazę obserwowano w temperaturze 35°C. Przeciwnie, l-asparaginazę z Chrombacteriaceae i Proteus vulgaris obserwowano odpowiednio w temperaturze 20°C i 57°C. Wykryto nieliniową zależność między asparaginazą I a stabilnością temperatury (Fig.8). Aktywność enzymu była stabilna do 37°C po inkubacji przez 1 h. Asparaginaza z V. unguiculata była stabilna do 40°C po inkubacji przez 15 minut . Asparaginazy z P. carotovorum i C. annuum zachowały swoją początkową aktywność po inkubacji odpowiednio w temperaturze 40°C i 45°C przez 60 minut .

Rysunek 7

optymalna temperatura asparaginazy i z P. vulgaris. Aktywność enzymu mierzono w różnych temperaturach przy użyciu standardowej metody oznaczania, jak opisano wcześniej.

Rysunek 8

stabilność termiczna asparaginazy i z P. vulgaris. Mieszaninę reakcyjną wstępnie inkubowano w różnych temperaturach przez 60 minut przed dodaniem substratu, a następnie oziębiono w łaźni lodowej. Aktywność enzymu mierzono stosując standardową metodę oznaczania, jak opisano wcześniej. Aktywność w czasie zerowym została uznana za aktywność 100%.

zbadano wpływ różnych jonów metali na asparaginazę I (Tabela 3). Zastosowano jony metali w stężeniu 10 mM. K+ był w stanie znacznie zwiększyć aktywność asparaginazy I o 150%. W roślinach zidentyfikowano asparaginazy niezależne od K+i zależne od K+. K+ działał również jako środek wzmacniający asparaginazę P. carotovorum . Ca2+ nieznacznie zwiększył aktywność o 110%, ale Cu2+ nieznacznie hamował aktywność asparaginazy I. Ponadto Pb2+ i HG2+ spowodowały częściowo hamujący wpływ na asparaginazę I. jednakże asparaginaza V. unguiculata była aktywowana przez Ni2+ i Co2+ i była hamowana przez Mn2+, Zn2+, Ba2+ i HG2+ . EDTA jako czynnik chelatujący metale powodował częściowo hamujący wpływ na asparaginazę I. Jednak EDTA nie miał wpływu na asparaginazę P. carotovorum .

4. Wnioski

l-asparaginazę i z P. vulgaris oczyszczono w postaci wolnej od glutaminazy, co może zmniejszyć możliwość wystąpienia działań niepożądanych w trakcie leczenia przeciwnowotworowego. Enzym wykazał dobrą stabilność w szerokim zakresie warunków fizjologicznych, takich jak pH i temperatura. W kolejnym etapie naszego projektu L-asparaginaza i z P. vulgaris zostanie wykorzystana jako potencjalny kandydat do leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej.

konflikt interesów

autorzy nie mają konfliktu interesów istotnych dla niniejszej pracy do ujawnienia.

podziękowania

ten projekt został sfinansowany przez National Plan for Science, Technology and Innovation (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Arabia Saudyjska, award no. (11-BIO-1516-03). Autorzy doceniają również z wdzięcznością jednostkę Nauki i technologii, King Abdulaziz University, za wsparcie techniczne.