Delecja Kdm6a, Demetylazy Histonowej oddziałującej z MLL2, u trzech pacjentów z zespołem Kabuki | Jumbuck

tekst główny

zespół Kabuki (KS; MIM 147920) został po raz pierwszy opisany w 1981 roku przez Niikawę i Kuroki,w literaturze opisano 1,2 i ponad 400 przypadków. Głównymi cechami klinicznymi są charakterystyczne cechy twarzy, opóźnienie rozwoju, łagodna do umiarkowanej niepełnosprawność intelektualna, poporodowe opóźnienie wzrostu i dodatkowe cechy, w tym anomalie szkieletowe, hipodoncja i trwałe opuszki palców płodu. Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) analiza mikromacierzy nie wykryła nawracającej anomalii u 72 osób KS.3-8 zastosowanie strategii sekwencjonowania egzomu doprowadziło ostatnio do identyfikacji mutacji MLL2 (MIM 602113) jako głównej przyczyny KS.9 w pięciu niedawno opublikowanych seriach mutacje w MLL2 stwierdzono u 56% -76% pacjentów z KS.9-13

ponieważ znaczna część pacjentów nie ma wykrywalnej mutacji MLL2, postulowaliśmy istnienie dodatkowych genów związanych z KS. W poszukiwaniu kolejnej mutacji genetycznej powodującej KS, dziesięć genów oddziałujących z MLL2 przebadano u 15 osób z mutacją mll2 ujemną i nie zidentyfikowano mutacji patogennych.11 inny gen kodujący oddziałujące z MLL2 białko, KDM6A (wcześniej znany jako UTX; MIM 300128), przebadano u 22 osób KS bez mutacji MLL2 i ponownie nie wykryto mutacji sprawczych.13

wykorzystując analizę array CGH (Agilent platform 244k), zidentyfikowaliśmy mikrodelecje de novo Xp11.3 u dwóch belgijskich dziewcząt z KS bez mutacji MLL2 (pacjenci 1 i 2). Ponieważ oba delecje były de novo, prawdopodobnie są patogenne. Obie delecje obejmowały część lub całość kdm6a. ponadto, nie było delecji KDM6A w kohorcie 411 prawidłowych grup kontrolnych w poprzednim badaniu.Delecja u pacjenta 1 obejmowała eksony kdm6a 21-29, które kodują końcową część domeny katalitycznej KDM6A, oraz cxorf36, Gen ostatnio związany z autyzmem związanym z X.U pacjenta 2 usunięto całkowicie KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) i FUNDC1 (Fig. Funkcje DUSP21 i FUNDC1 pozostają nieznane.

Region Xp11.3 pokazuje delecje pacjentów

Region Xp11.3 pokazuje delecje pobrane z przeglądarki genomu UCSC (GRCh37/hg19) dla pacjentów 1, 2 i 3. Czarne pełne ścieżki oznaczają usunięcie każdego pacjenta, a numer każdego pacjenta znajduje się nad jego ścieżką. Usunięcie u pacjenta 1 obejmuje 283,5 kb od bazy 44,941,324 do bazy 45,224,829, usunięcie u pacjenta 2 obejmuje 815.7 kb od bazy 44,377,858 do bazy 45,193,629, a delecja pacjenta 3 obejmuje 45,4 kb od bazy 44,866,302 do bazy 44,912,718. Geny w tym obszarze są odnotowywane pod śladami delecji. CNVs w bazie danych wariantów genomowych są pokazane na dolnej linii. Nie ma wcześniejszych raportów o zmianach numeru kopii KDM6A.

następnie zsekwencjonowaliśmy KDM6A przez sekwencjonowanie Sangera i szukaliśmy wewnątrzgenicznych delecji lub duplikacji z ukierunkowaną niestandardową Macierzą Agilent CGH w kohorcie 22 osób Ks z mutacją mll2 (8 kobiet, 14 mężczyzn). Zgodnie ze standardami etycznymi komitetu etyki Institut de Pathologie et de Génétique uzyskano zgodę rodziców na analizę DNA wszystkich uczestników tego badania oraz na publikację zdjęć. Dane CGH microarray (dane uzupełniające, dostępne online) omówione w niniejszej publikacji zostały zdeponowane w National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO)16 i są dostępne w ramach akcesji gse32567 (patrz sekcja numery akcesyjne).

nie wykryto mutacji punktowych, ale zidentyfikowaliśmy delecję wewnątrzgeniczną de novo (eksony 5-9) u jednego włoskiego, męskiego osobnika z KS (pacjent 3). Zsekwencjonowaliśmy UTY (MIM 400009), paralog chromosomu Y kdm6a (patrz poniżej) i szukaliśmy wewnątrzgenicznych delecji lub duplikacji, jak wspomniano powyżej, ale nie wykryliśmy żadnych mutacji.

u pacjentów 1. i 3. występował typowy fenotyp KS, obejmujący długie szczeliny powiekowe, boczne odchylenie dolnej powieki oraz umiarkowaną do ciężkiej niepełnosprawność intelektualną (Tabela 1 i rycina 2). Chociaż rysy twarzy pacjentki 2 nie były tak Klasyczne, wykazywała wiele cech tego zaburzenia, w tym boczną rzadkość brwi, długie rzęsy, zez, długie szczeliny powiekowe, duże i wydatne uszy, trwałe opuszki palców płodu, koarktacja aorty, pełnia areolarna w niemowlęctwie i hirsutyzm. Zaprezentowała się z łagodnym opóźnieniem rozwojowym i miała normalny iloraz inteligencji werbalnej (IQ), słaby wynik IQ wydajności i zachowanie nadpobudliwe (Tabela 1 i rysunek 2). Zauważyliśmy, że pacjenci 1 i 2 mieli długie halucynacje (ryc. 3).

wygląd twarzy u osób dotkniętych chorobą

(a) pacjent 1.

B) Pacjent 2.

(C) Pacjent 3.

zwróć uwagę na długie szczeliny powiekowe u pacjentów 1 i 2 oraz łukowate brwi u pacjentów 1 (łagodne) i 3.

wygląd stóp u osób dotkniętych chorobą

(a) pacjent 1.

B) Pacjent 2.

zwróć uwagę na długie halucynacje u obu pacjentów.

tak więc delecje KDM6A u tych trzech pacjentów są związane z szerokim spektrum fenotypowym, od typowych osób z KS (pacjenci 1 i 3) do łagodniejszej prezentacji klinicznej (pacjent 2). Ta zmienność kliniczna jest również cechą pacjentów z mutacjami MLL2.Jednakże należy również rozważyć możliwy wpływ delecji CXorf36 u pacjenta 1 oraz delecji cxorf36, DUSP21 i FUNDC1 u pacjenta 2 na ich odpowiednie fenotypy.

KDM6A (29 eksonów) jest jednym z genów chromosomu X, który w dużej mierze ucieka przed inaktywacją X.17 koduje białko reszty 1401, które zawiera dwie domeny funkcjonalne. Domena katalityczna jest demetylazą histonową, która specyficznie katalizuje demetylację mono-, di-i trimetylowanej lizyny 27 na histonie H3 (H3K27).18,19 ta demetylacja pośredniczy w ekspresji specyficznej dla tkanek różnych genów i jest głównie zaangażowana w procesy rozwojowe i cykl komórkowy.19-22 co ciekawe, KDM6A i MLL2 działają razem w epigenetycznej kontroli transkrypcyjnie aktywnej chromatyny, przeciwdziałając białkom z grupy Polikombowej (PcG).22 Inna domena funkcjonalna kdm6a odgrywa rolę w przebudowie chromatyny poprzez interakcję z kompleksem przebudowującym switch/sacharoza nonfermentable (SWI/SNF), który zawiera aktywator transkrypcji Brg1.23

podobnie jak MLL2, KDM6A odgrywa rolę w embriogenezie i rozwoju. Homozygotyczny dUTX (Drosophila kdm6a ortholog) mutanty Drosophila wykazują szorstkie Oczy, dysmorficzne skrzydła i modyfikację grzebienia płciowego.21 fenotyp ten przypomina fenotyp trithorax, co dodatkowo potwierdza tezę, że KDM6A przeciwdziała represji PcG.21 ponadto UTX-1 (C. elegans kdm6a ortholog) może wpływać na decyzje o losach rozwojowych w komórkach prekursorowych sromu C. elegans poprzez regulację transkrypcji genów kodujących kompleks białek siatkówki (RB), który został zachowany od robaków do ludzi.20 Kdm6a1 jest również ważne w ekspresji tylnych genów HOX u danio pręgowanego.19 ponadto KDM6A wraz z MLL2 odgrywa ważną rolę w regulacji genów specyficznych dla mięśni podczas embriogenezy.22,24 wreszcie, członkowie innej ważnej rodziny genów rozwojowych (geny T-box, które działają w mezodermie w tworzeniu serca i kręgów) rekrutują kdm6a do aktywacji swoich genów docelowych, ponownie podkreślając rolę KDM6A w procesach rozwojowych.23 Co ciekawe, większość mutacji patogennych dla opisywanych genów T-box w chorobach ludzkich znajduje się w domenie T-box, która współdziała z KDM6A.23

KDM6A ucieka przed inaktywacją X, 17 ale zasugerowano, że u myszy ekspresja Kdm6a z nieaktywnego chromosomu X jest znacznie niższa niż z aktywnego chromosomu X.Ekspresja 25 Kdm6a jest wyższa w dorosłym mózgu, dorosłej wątrobie i specyficznych rozwijających się regionach mózgu u kobiet niż u mężczyzn.25 UTY jest paralogiem KDM6A na chromosomie Y.UTY ma 84% podobieństwa sekwencji aminokwasowych z kdm6a i może kompensować zwiększoną ekspresję KDM6A u kobiet, pomimo faktu, że aktywność demetylazy nie została jeszcze wykazana dla tego paralogu kdm6a.14,25

nie jest zaskakujące znalezienie innego genu związanego z KS na chromosomie X, ponieważ istnieją doniesienia o pacjentach podobnych do KS z małymi chromosomami pierścieniowymi X (r).26-34 ponadto, istnieje wyraźne nakładanie się między wrodzonymi wadami serca występującymi u pacjentów z KS u mężczyzn(koarktacja aorty i inne lewostronne przeszkody) a wadami występującymi u pacjentów z monosomią X i chromosomami r (X).28,35 małych chromosomów r (X) zazwyczaj prowadzi do zespołu Turnera poprzez całkowitą inaktywację r (X). Nie jest jednak jasne, dlaczego niektóre osobniki rozwijają fenotyp podobny do KS. Niekompletna inaktywacja chromosomu X i późniejsza ekspresja Zwykle Represjonowanych genów zostały zasugerowane jako wyjaśnienie fenotypu KS u niektórych pacjentów z r (X).32-34 kdm6a zostało usunięte u trzech pacjentów, którzy mieli zarówno fenotyp podobny do KS, jak i r(X), w których odwzorowano wartości graniczne; to odkrycie jest zgodne z hipotezą, że delecja KDM6A odgrywa ważną rolę w fenotypie podobnym do KS obserwowanym u niektórych pacjentów z r(X).30,32,34 nie byliśmy w stanie udowodnić haploinsufficiency dla kdm6a u pacjentów 1 i 2, ponieważ ekspresja KDM6A była bardzo niska w limfocytach krwi obwodowej (dane nie pokazano). Niemniej jednak, badania wykazały,że dwie kopie Kdm6a są niezbędne do prawidłowej ekspresji u samic zarodków myszy i dorosłych myszy 25, co sugeruje, że haploinsufficiency mogą być mechanizmem chorobotwórczym. Jednak to wyjaśnienie nie wyjaśniałoby faktu, że u 45, X i innych pacjentów z delecją KDM6A nie wszyscy rozwijają fenotyp Kabuki.

u pacjentów 1. i 2. molekularne współczynniki inaktywacji X są silnie Przekrzywione i wynoszą odpowiednio 89:11 i 97:3. Profil inaktywacji X określono poprzez amplifikację powtórzeń CAG w eksonie 1 genu receptora androgenowego przed i po trawieniu DNA z HpaII i CfoI. Aby ustalić, czy usunięta Kopia kdm6a znajduje się na aktywnym lub nieaktywnym chromosomie X, wykonaliśmy analizę fluorescencji in situ hybrydyzacji (FISH) za pomocą sondy kdm6a na chromosomach X, które zostały różnie oznaczone przez włączenie 5-bromo-2′-deoksyurydyny (5-BrdU). Wyniki wykazały, że usunięta Kopia KDM6A znajdowała się na nieaktywnym chromosomie X we wszystkich 70 mitozach analizowanych u obu pacjentów (rycina 4). Fakt, że kdm6a ucieka od inaktywacji X17 sugeruje, że limfocyty stymulowane fitohemaglutyniną (PHA), które mają usuniętą kopię kdm6a na nieaktywnym chromosomie X, mają przewagę nad liniami komórkowymi, które mają usuniętą kopię kdm6a na aktywnym chromosomie X. Ta sugestia jest zgodna z hipotezą, że chociaż KDM6A ucieka od inaktywacji X, jego ekspresja jest niższa od nieaktywnego chromosomu X niż od aktywnego chromosomu X.25

Image of fish Study on X Chromosomes Differentially Labeled with 5-BrdU

image of a FISH study shows x chromosomes differentially labeled by the incorporation of 5-BrdU. Nieaktywny chromosom X (w białym okręgu) wydaje się jaśniejszy niż aktywny chromosom X. Sondy subtelomeryczne xqter hybrydyzują do obu chromosomów X (niebieskie strzałki). Sygnał KDM6A (biała strzałka) jest nieobecny na nieaktywnym chromosomie X i jest obecny na aktywnym chromosomie X. W tym eksperymencie limfocyty krwi obwodowej pacjentów 1 i 2 stymulowano fitohemaglutyniną i hodowano przez 72 godziny. w celu identyfikacji opóźnionego replikującego się nieaktywnego chromosomu X, przed pobraniem komórek poddano działaniu 5-BrdU (30 µg/ml) 5 godzin. Następnie dodano Colcemid w stężeniu 0,2 µg/ml, a 1 godzinę później otrzymano preparaty metafazy za pomocą standardowych procedur obejmujących pęcznienie w 75 mM KCl i utrwalanie w 3:1 metanolu / kwasie octowym. Przeprowadziliśmy analizę ryb, używając jednocześnie subtelomerycznej sondy Xqter oznaczonej SpectrumOrange (Vysis) w celu wskazania chromosomów X (niebieska strzałka) i RP11-435k1 oznaczonych SpectrumOrange (AmpliTech) w celu rozróżnienia między usuniętymi i nieusuniętymi chromosomami X (biała strzałka). Aby ułatwić wykrywanie wbudowanego 5-BrdU, denaturowaliśmy komórkowe DNA w 2n HCl przez 30 minut w temperaturze 37°C. 5-BrdU oznaczono następnie swoistym przeciwciałem monoklonalnym 5-BrdU sprzężonym z fluoresceiną (Roche) (1 µg / ml). Na koniec przeciwstawiliśmy DNA stosując roztwór antyfadowy zawierający 0.1 µg / ml DAPI.

rola UTY jest w dużej mierze nieznana i nie wykazuje aktywności demetylazy in vitro. Ustalenie męskiego osobnika z KS (pacjent 3) z delecją wewnątrzgeniczną kdm6a i nasileniem klinicznym podobnym do tego u pacjenta 1 sugeruje, że UTY może częściowo zrekompensować utratę kdm6a u mężczyzn, jak wcześniej sugerowano w literaturze.

co do MLL2, somatyczne mutacje homozygotyczne i hemizygotyczne w KDM6A zostały zidentyfikowane w różnych typach raka (szpiczak mnogi, rak płaskonabłonkowy przełyku, rak nerki, białaczka szpikowa, rak piersi, Rak jelita grubego i glejak), co sugeruje, że KDM6A jest genem hamującym nowotwór.Niemniej jednak rak nie jest kluczową cechą KS,biorąc pod uwagę, że powikłanie to zostało zgłoszone tylko u siedmiu pacjentów z KS36, 37 (ostra białaczka limfoblastyczna, chłoniak Burkitta, mięsak fibromiksoidalny, mięsak maziowy i hepatoblastoma odnotowano raz, a neuroblastoma odnotowano u dwóch osób z KS).35,36 jeśli utrata obu alleli jest wystarczająca do wywołania raka, można by oczekiwać, że nowotwór pojawi się częściej w KS, na przykład w siatkówczaku (mim 180200) lub w guzie Wilmsa (mim 194070). Sugeruje to, że utrata drugiego allelu w MLL2, KDM6A lub UTY jest konieczna, ale niewystarczająca do rozwoju raka, lub że powikłanie to jest niedostatecznie poznane, co dowodzi znaczenia Badań Historii Naturalnej w rzadkich zespołach.37

następujące metylazy histonowe i demetylazy histonowe były zaangażowane w inne zespoły anomalii mnogich: EHMT1 (mim 607001; zespół Kleefstra ), SETBP1 (mim 611060; zespół Schinzela-Giediona ), JARID1C (mim 314690; zespół upośledzenia umysłowego typu Claesa-Jensena, X-linked mental-retardation syndrome ), PHF8 (mim 300560; Syndrom upośledzenia umysłowego typu sideriusa (ang. Siderius-type, X-linked mental-retardation syndrome) oraz MLL2 w KS. Identyfikacja mutacji patogennych KDM6A u chorych na KS rozszerza rolę czynników modyfikacji histonów w niepełnosprawności intelektualnej i wadach wrodzonych.

podsumowując, zgłaszamy mutacje KDM6A jako przyczynę KS u jednego mężczyzny i dwóch kobiet. Nasze odkrycia potwierdzają zarówno heterogeniczność genetyczną KS, jak i locus na chromosomie X, jak sugerowano wcześniej. Ponieważ u niektórych pacjentów z KS wynik był negatywny na sekwencjonowanie MLL2, KDM6A i UTY i nie wykazywał delecji ani duplikacji podczas badań przesiewowych, jest prawdopodobne, że inne geny związane z KS pozostają do odkrycia.