wprowadzenie
Biotechnologia wykorzystuje mikroorganizmy, a także wyższe komórki i ich aktywne zasady w celu osiągnięcia pożądanych konwersji różnych substratów (Tripathi et al., 1997). L-fenyloacetylo karbinol jest materiałem wyjściowym do syntezy chemicznej chlorku l-efedryny i pseudo efedryny związków farmaceutycznych stosowanych jako środek zmniejszający przekrwienie, przeciwastmatyki (Shin and Rogers, 1995) i ostatnio zgłaszane, stosowane w kontroli otyłości (Astrup et al., 1992). Aromatyczny substrat benzaldehyd Da L-PAC metodą biotransformacji. Niektóre szczepy drożdży posiadają enzymy dekarooksylazy pirogronianowej (PDC) i dehydrogenazy alcholowej (ADH), które wytwarzają odpowiednio l-PAC i alkohol benzylowy, produkt uboczny, z benzaldehydu (Nikolova i Ward, 1991). Potencjał biotransformacji rosnących komórek wolne zebrane komórki unieruchomione komórki i wyizolowany surowy, a także oczyszczony enzym zostały szeroko zbadane przez bee N (Liew et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a, b).
rola nowych szczepów w biokonwersji jest ważnym aspektem. Wytwarzanie L-PAC badano na wolnych i unieruchomionych komórkach saccharomyces cerevisiae w różnych warunkach wzrostu i biotransformacji. Ale badaliśmy produkcję L-PAC z benzaldehydu, stosując różne nowe szczepy w różnych metodach wzrostu i biotransformacji w celu monitorowania idealnych warunków umożliwiających maksymalną wydajność produktu przy stałym stężeniu substratu i gęstości komórek. Produkcja L-PAC jest podana w Schemacie 1.
| Schemat 1: | |
materiały i metody
produkcja L-Fenyloacetylo-karbinolu z normalnymi komórkami Sccharomuces Cerevisiae (BY)
produkcja l-Pac (kluczowego półproduktu dla wielu leków) z benzaldehydu przez drożdże jest potencjalną drogą w przemyśle fermentacyjnym do produkcji efedryny i innych leków. Niniejsze badanie zostało przeprowadzone przez autora w Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, z siedzibą w Hyderabad, Indie W roku 2004.Hodowlę bazową drożdży piekarskich świeżo subkulturowano (Ellaiah and Krishna, 1987)na świeżych sterylnych średnich skosach YEMA i inkubowano w temperaturze pokojowej (około 28°C) przez 36 godzin. Hodowlę drożdży piekarskich zbierano przez wstrząsanie w 5 mL sterylnej wody. Zebrana zawiesina drobnoustrojów została przeniesiona do pożywki inokulum-I. skład pożywki inokulum jest następujący:
kolbę inkubowano w temperaturze 28°C na wytrząsarce obrotowej (180 obr. / min) przez 24 godziny.
liczba drobnoustrojów została wykonana za pomocą komory liczenia Neubauera. Zawiesinę drobnoustrojów rozcieńczono tak, aby każdy mL zawiesiny zawierał 200×106 komórek. Dziesięć mililitrów inokulum z IM-I przeniesiono do 100 mL środka inokulacyjnego-II skład who jest wskazany poniżej:
kolby inkubowano na wytrząsarce obrotowej (180 obr / min) przez 16 godzin.
przygotowano sto mililitrów mediów produkcyjnych. W większości badań jako nośnik produkcyjny wykorzystano melasę, a do badań porównawczych pożywkę z soku trzciny cukrowej z mocznikiem. Dziesięć mililitrów inokulum z IM-II przeniesiono do mediów produkcyjnych, których skład jest taki sam jak IM-II i inkubowano przez 9 godzin na wytrząsarce obrotowej. Po 9 h do podłoża produkcyjnego melasy dodano składniki odżywcze (20 mL 50% melasy), a do podłoża produkcyjnego trzciny cukrowej-składniki odżywcze (20 mL 50% soku z trzciny cukrowej) i inkubowano na obrotowym shakerze. Od 10 h dalej 0.6% destylowanego benzaldehydu dodawano w 6 podzielonych dawkach w odstępach półgodzinnych do podłoża produkcyjnego.
następnie kolby inkubowano na obrotowym shakerze przez 24 godziny. kolby zawierające 130 mL bulionu (tj. 100 mL pożywki produkcyjnej+10 mL inokulum+20 mL pożywki) potraktowano 130 mL benzenu (rozpuszczalnika) i wstrząsano przez 5 minut w lejkach oddzielających. Następnie warstwę organiczną oddzielono i przesączono przez chłonną bawełnę. Wreszcie rozpuszczalnik benzen destylowano, aby uzyskać produkt L-PAC.
produkcja L-Fenyloacetylo-karbinolu z nowymi izolatami drożdży:
procedury biokonwersji:
w badaniach porównawczych wykorzystano nowe kultury do oszacowania i porównania ich potencjału biotransformacyjnego z drożdżami piekarskimi. Hodowle podstawowe Candida pseudointermedia MTCC No. 6225, Candida pseudountermedia MTCC No. 6352 i Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 były subkulturowane aseptycznie na skosach Strile YEMA ze sterylizowaną pętlą przenoszącą w sterylnym obszarze (laminarny przepływ powietrza).
wcześniej wspomniana procedura (Ellaiah and Krishna, 1987)została powtórzona również w powieści. W większości badań jako medium produkcyjnego użyto melasy, a do badań porównawczych jako medium produkcyjnego użyto soku z trzciny cukrowej z mocznikiem (Kaur i Kocher, 2002).
wyniki i dyskusja
l-fenyloacetylo-karbinol jest cieczą koloru żółtego. Jego ciężar właściwy wynosi 0,93 w temperaturze pokojowej. L-PAC wytwarzany przez Izolaty, w tym drożdże piekarnicze (S. cerevisia), wykazywał tę samą wartość ciężaru właściwego. wartość pH L-PAC (stosunek 1: 1 próbki l-PAC i wody) podaje się jako 3,84. W tych doświadczeniach produkt L-PAC otrzymany w wyniku biotransformacji przez cztery różne drożdże, takie jak drożdże piekarskie, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) i Issatchenkia orientials (6351), wykazał te same wartości pH. Odnotowano wartość Rf L-PAC (Groger i Erge, 1965)w chloroformie, ponieważ do wykrywania plam użyto ruchomej fazy na żelu krzemionkowym.
w opracowaniu chromatogramów chloroform jako przedni rozpuszczalnik porównano z mieszaniną rozpuszczalników (30% octanu etylu 70% heksanu) jako fazą ruchomą. Późniejszy front rozpuszczalnika wykazał lepszą separację niż chloroform. We wszystkich naszych eksperymentach użyliśmy 30% octanu etylu i 70% heksanu jako rozpuszczalnika.
L-PAC jest reaktywny w świetle UV, oparach jodu i zwęglaniu β-Metoksynaftalenu. Wartość Rf standardowego L-PAC wynosi około 0,33. Produkt L-PAC różnych izolatów wykazał tę samą wartość Rf.
keton metylowy obecny w L-PAC podlega reakcji Idoform (Smith i Hendlin, 1954). Początkowo ulega halogenowaniu i rozszczepianiu w obecności alkaliów, takich jak NaOH, dając początek Idoform. Reakcja ta jest bardzo specyficzna dla L-PAC i nie występuje z produktami by. L-PAC wytwarzany przez różne Izolaty dał początek Idoform.
na podstawie szacunków polarymetrycznych i kolorymetrycznych oszacowano procentową biokonwersję w różnych izolatach drożdży. Inne produkty fermentacji (np. alkohol benzylowy, kwas benzoesowy, a także niekonwertowany benzaldehyd oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatografii gazowej (GC). Struktura chemiczna L-PAC została zidentyfikowana i dostosowana do danych widmowych 1H NMR i UV.
kilku pracowników (Ellaiah and Krishna, 1987) przeprowadziło fermentację w melasie jako medium produkcyjnym, oprócz tego w przemyśle stosuje się melasę do reakcji biokonwersji w produkcji L-PAC.
w niniejszym dochodzeniu próbowaliśmy soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnego w produkcji L-PAC. Jako medium produkcyjnego użyto soku z trzciny cukrowej o zawartości mocznika 0,25%, który dawał więcej produktu L-PAC niż melasa. Oprócz tego produktu ekstrakcja z pożywki soku z trzciny cukrowej była bardzo wygodna niż ze pożywki melasowej. % Biokonwersji uzyskanej z różnymi izolatami drożdży przedstawiono w tabeli 1.
potencjał Biotransformacyjny wolnych komórek drożdży piekarskich (S. cerevisiae) badano zarówno w melasie, jak i soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnym. W melasie stwierdzono biokonwersję 25%, gdzie podobnie jak w soku z trzciny cukrowej stwierdzono biokonwersję 28%.
| Tabela 1: | Konwersja melasy i soku z trzciny cukrowej jako mediów produkcyjnych przy produkcji L-PAC |
potencjał Biotransformacyjny wolnych komórek Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 badano zarówno w melasie, jak i soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnym. W melasie stwierdzono biokonwersję 23,43%, a w środowisku soku trzciny cukrowej 23,75% biokonwersję.
potencjał Biotransformacyjny wolnych komórek Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 badano zarówno w melasie, jak i soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnym. W melasie stwierdzono biokonwersję 33,47%, a w środowisku soku z trzciny cukrowej 48,76% biokonwersję.
potencjał Biotransformacyjny wolnych komórek Issatchenkia orientalis MTCC No.6351 badano zarówno w melasie, jak i soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnym. W melasie stwierdzono biokonwersję 37,16%, a w środowisku soku trzciny cukrowej 60,61% biokonwersję.
wnioski
podsumowując, zbadano i zastosowano niniejszą procedurę stosowania nowych szczepów drożdży ze źródeł naturalnych do badań biotransformacyjnych w celu biokonwersji benzaldehydu do L-PAC. Trzy szczepy zostały wyizolowane z różnych naturalnych źródeł, takich jak blackgrapes, daktyle i sok z trzciny cukrowej i zostały zidentyfikowane w Institute of Microbial Technology, Chandigarh. Te trzy szczepy oznaczono jako Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC No.6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY).Które będą ważnym uzupełnieniem obecnych procedur. Najistotniejszymi wynikami badań są Zastosowanie 3 nowych szczepów drożdży do produkcji L-PAC oraz wykorzystanie soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnego do produkcji L-PAC. Obie próby są udane i następuje znaczny wzrost wydajności procentowej L-L-PAC, gdy sok z trzciny cukrowej był używany jako medium produkcyjne. Chociaż sok z trzciny cukrowej jest drogi w porównaniu do melasy, procedura ekstrakcji okazała się znacznie łatwiejsza w przypadku soku z trzciny cukrowej w porównaniu do melasy. Dalsze metody badawcze, takie jak różne czynniki, badania unieruchomienia, badania mutacji itp., może pomóc w ustaleniu opłacalnych metod produkcji L-PAC poprzez wykorzystanie soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnego. Jest to pierwszy raport na temat stosowania Candida pseudointermedia i Issatchenkia orientalis do badań biokonwersji benzaldehydu do L-PAC. Zastosowanie soku z trzciny cukrowej jako medium produkcyjnego w badaniach biotransformacji benzaldehydu do L-PAC jest również pierwszym tego rodzaju raportem. Ponadto sok z trzciny cukrowej wykazywał zwiększony potencjał biokonwersji niż podłoże melasowe. Nowe szczepy, które możemy zbadać dla różnych reakcji chemicznych. Trwają dalsze badania w tym kierunku.
podziękowania
autorzy są wdzięczni IMTECH, Chandigarh za identyfikację nowych szczepów i przypisanie numerów MTCC.
