Test kinazy
przygotowany przez Swathi Arur
kinazy białkowej (roztwory podstawowe 1-10 mg/ml czystych kinaz) – do tych testów używam oczyszczonej kinazy ERK2 (NEB). Dla każdego enzymu ważne jest określenie optymalnego bufora, siły jonowej i pH dla aktywności. Jeśli warunki te nie zostały ustalone, protokół wymieniony poniżej może być użyty jako punkt wyjścia.
substrat (roztwór podstawowy 10 mM) – substraty zazwyczaj zawierają jedną serynę / treoninę w miejscu fosforylacji. Jako kontrolÄ ™ stosujÄ ™ podstawowe białko mielinowe (otrzymywane z Sigma), ktĂłre byĹ ’ o uĺźywane przez NEB do kalibracji kinazy ERK2.
ponadto substraty powinny mieć dodatni ładunek netto, aby ułatwić wiązanie z filtrami fosfocelulozowymi stosowanymi w teście. W celu ilościowego wiązania z papierem fosfocelulozowym zaleca się posiadanie co najmniej 2 reszt zasadowych i wolnego końca aminowego. Jeśli motyw miejsca fosforylacji nie jest znany, można zastosować ogólny substrat kinazy tyrozynowej. Na przykład „mielina podstawowe białko” (jest niespecyficznym substratem dla wielu mapek). W przypadku reakcji początkowych należy zastosować stężenie substratu 0,7-1,5 mM. Aby określić parametry kinetyczne fosforylacji syntetycznego peptydu, wymagany jest zakres stężeń peptydów
10x Bufor kinazy – zawiera 5 mg/mL BSA (aby zapobiec adsorpcji kinazy do probówki), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (zakupiony od Upstate Biotech-Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – wygodny jest roztwór podstawowy 1-5 mM. Zauważ, że większość Mapków ma wartości Km dla ATP w zakresie 10-150 uM, więc w eksperymentach kinetycznych ważne jest użycie nasycających stężeń ATP, aby uzyskać wartości Km i Vmax dla peptydów.
ATP – 10 mCi/mL.
testy kinazy ERK2
a) test AUTORADIOGRAFICZNY:
- standardowy test kinazy przeprowadza się w objętości 25 ul:
- 2,5 ul buforu 10x kinazy
- 5 ul 1,0 mM MgCl2 / ATP (stężenie końcowe 0,2 mM)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul 10 mM substratu (1.2 mM stężenie końcowe)
- 1 U kinazy ERK2
- H2O do 25 ul
1. Przed eksperymentami przygotuj koktajl zawierający wystarczającą ilość buforu, ATP i ATP, aby zakończyć testy. W przypadku testów przy różnych stężeniach substratu podłoże należy rozcieńczyć i dodać oddzielnie do każdej probówki. Po dozowaniu koktajlu do 1,5 ml rurek z mikroprzepływem umieść rurki w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni C na 30 minut. Reakcje należy rozpocząć przez dodanie kinazy i pozostawić do działania w temperaturze 30 stopni C.
2. Po żądanym czasie zakończyć reakcje, dodając 2 x bufor próbki SDS i wyczerpać żel.
3. Żel osuszyć na papierze Whatman 3.0 i wystawić suchy żel na autoradiogram i przechowywać kasetę w temperaturze-70C przez 2 godziny. (w przypadku dłuższych ekspozycji upewnij się, że film jest ponownie suchy przed nałożeniem nowego autoradiogramu).
b) analiza kinetyczna:
1. Przeprowadzić test kinazy jak powyżej, tym razem użyć różnych stężeń substratów, począwszy od 50nM do 1mM. Zatrzymać reakcję po 30 minutach, dodając do każdej reakcji 45 UL zimnego 10% kwasu trichlorooctowego (TCA). Wir reakcji.
3. Wiruj przez 2 minuty w mikrokrążeniu (10K obr. / min).
4. Spot 35 ul supernatantów na 2,1-cm średnicy Whatman P81 celulozowo-fosforanowe kręgi filtracyjne.
6. Okręgi filtra P81 przemyć trzykrotnie 500 ml zimnego 0,5% kwasu fosforowego (5-10 minut na pranie). Postęp etapów mycia można śledzić, usuwając okrąg filtra P81 w celu uzyskania ślepej reakcji i sprawdzając go za pomocą licznika Geigera.
7. Umyć raz 200 ml acetonu w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
8. Pozostawić do wyschnięcia koła filtra w temperaturze pokojowej.
9. Włożyć okręgi filtracyjne do fiolek scyntylacyjnych i zmierzyć inkorporację 32P, licząc suche podkładki w liczniku scyntylacyjnym. Specyficzną aktywność ATP w reakcji kinazy (np. w cpm / pmol) można określić przez plamienie małej próbki (2-5 ul) reakcji na okrąg filtra P81 i bezpośrednie liczenie (bez przemywania). Liczby na minutę uzyskane w reakcji kinazy (minus ślepa próba) są następnie dzielone przez specyficzną aktywność w celu określenia moli fosforanu przenoszonego w reakcji.
Kinetyka fosforylacji substratu
parametry kinetyczne fosforylacji substratu za pomocą MAPK można określić za pomocą zmiany w powyższym protokole.
1. Przeprowadzić reakcję przy wysokim stężeniu substratu, aby ustalić, że białko jest substratem.
2. Zmieniać stężenie enzymu w teście. Szybkość fosforylacji substratu powinna być proporcjonalna do stężenia enzymu w warunkach badania. Ten eksperyment jest również używany do określenia ilości enzymu potrzebnego do badań kinetycznych.
aby określić szybkość, należy przeprowadzić czasowy przebieg fosforylacji substratu. W takim przypadku przygotuj większą reakcję enzymatyczną(używamy 150 ul). W żądanych punktach czasowych pobrać 25 porcji ul i przenieść je do rurek mikrokrążenia zawierających 45 ul lodowatego 10% TCA i przeanalizować reakcje opisane powyżej. Fosforylacja substratu powinna być liniowa w czasie, a do pomiaru stałych kinetycznych należy zastosować początkowe szybkości reakcji (5%).
3. Zmiana stężenia substratu w teście. Użyj wykresu prędkości względem stężenia peptydu, aby uzyskać wstępne oszacowanie wartości Km. W tym początkowym pomiarze należy zastosować szeroki zakres stężeń substratów (np. 20 uM do 2 mM).
4. Aby określić Km (substrat) i Vmax, należy zmienić stężenie substratu i zmierzyć szybkość transferu fosforanów. Dobrym zakresem stężeń substratów są następujące wielokrotności Km: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Reakcje należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach, aby uzyskać najlepsze wyniki.
5. Stałe kinetyczne są określane przez ważone nieliniowe najmniejsze kwadraty dopasowane do prędkości hiperbolicznej w porównaniu z wykresami za pomocą programów iteracyjnych, takich jak Nfit (produkty wyspowe, Galveston, TX).
obliczanie RAR:
RAR: względny stosunek akceptora = Vmax / Km zdefiniowany jako ogólna miara zdolności białka do działania jako substrat.
normalizuję RAR danego substratu za pomocą białka zasadowego mieliny, tzn. obliczam wartość RAR Dla każdego substratu, a następnie dzielę ją przez wartość RAR białka zasadowego mieliny (ustalając w ten sposób MBP na 1,0).
