strukturalna podstawa rozpoznawania łańcucha ub połączonego z K48 przez receptor proteasomalny rpn13

łańcuch ub połączony z K48 dynamicznie waha się wśród wielu konformacji

użyliśmy smFRET do oceny przestrzennego ułożenia dwóch podjednostek Ub w wolnym od ligandów K48-diUb. Wprowadziliśmy fluorofory, Alexa Fluor 488 i Cy5, na N-końcu dystalnego Ub i C-końcu proksymalnego Ub(dodatkowe rys. S1a). Korzystając z algorytmu maksymalizacji oczekiwań32, profil smFRET K48-diUb można najlepiej opisać jako trzy nakładające się na siebie gatunki progów (dodatkowe rys. S2). Gatunki o wysokiej, średniej i niskiej progu są wyśrodkowane przy wydajności progu 0,74, 0,57 i 0,23, z odpowiednimi populacjami ~48, ~39 i ~13% (Fig. 1a). Odległości progu między centrum fluoroforów są obliczane odpowiednio na ~43, ~50, ~64 Å. W ten sposób gatunki o wysokim, średnim i niskim progu mogą być przypisane do zwartych, półotwartych i otwartych stanów, które istnieją wcześniej dla K48-diUb.

a z fluoroforami sprzężonymi w miejscu 76 C bliższego Ub i 0 C dystalnego Ub (por. Dodatkowe Rys. S1a), profil smFRET może być montowany do trzech nakładających się gatunków progów. O ile nie zaznaczono inaczej, Ta para miejsc koniugacji jest używana do wszystkich badań smFRET K48-diUb. Gatunek wysokogórski (kolor czerwony) odpowiada wcześniej istniejącemu zwartemu stanowi. b-d stan zwarty może być selektywnie wzbogacony przez Pełnowymiarowy Rpn13, a wzrost populacji może być dopasowany do wiązania izotermy. np. stan zwarty może być selektywnie wzbogacony przez Rpn13NTD, a wzrost populacji może być przystosowany do wiązania izotermy. h z fluoroforami sprzężonymi w miejscach N25C/n25c, Rpn13NTD może selektywnie wzbogacić istniejący wcześniej stan zwarty dystalnej diUb K48-tetraUb(por. Dodatkowe Rys. S5), dające powinowactwo wiązania. Populacje gatunków smFRET są uśredniane na podstawie trzech niezależnych pomiarów, z błędami wskazującymi 1 SD; wartości KD są zgłaszane jako najlepiej dopasowane ± błędy dopasowania

fluktuacja konformacyjna K48-diUb była wcześniej badana przy użyciu smFRET26. W tym badaniu autorzy rozwiązali dwa gatunki smFRET dla K48-diUb, a mianowicie gatunki o wysokim progu i niskim progu z efektywnością progów środkowych odpowiednio 0,69 i 0,41, oprócz gatunków bez progu. Autorzy wykazali, że miareczkowanie inaktywowanej OTUB1 (OTUB1i), deubikwitynazy swoistej dla wiązania Izopeptydowego k4833, wzbogaca głównie gatunki o niskich progach. Ich obserwacja doprowadziła do wniosku, że K48-diUb może być wyraźnie rozpoznawany przez OTUB1 poprzez mechanizm selekcji konformacyjnej. Tutaj powtórzyliśmy miareczkowanie smFRET i stwierdziliśmy, że OTUB1i wzbogaca gatunki o średnim progu (dodatkowe rys. S3a-c). Ponadto wzrost populacyjny gatunków o średnich progach po miareczkowaniu OTUB1i można dopasować do izotermy wiązania o wartości KD 7,7 ± 0.1 µM (rys. uzupełniająca S3d), który jest zbliżony do wartości KD wcześniej zgłoszonej26. Tak więc gatunki o średnim progu w niniejszym badaniu powinny odpowiadać gatunkom o niskim progu w poprzednim badaniu, A rozbieżność może wynikać z różnych wydajności liczenia fotonów i procedur dopasowywania śladów czasu smFRET.

aby dodatkowo potwierdzić, że K48-diUb waha się między trzema istniejącymi wcześniej Stanami konformacyjnymi, wprowadziliśmy fluorofory w dodatkowych parach miejsc koniugacji fluoroforów (dodatkowa Fig. S1b-d). Dla alternatywnych miejsc, chociaż wydajność centrum FRET gatunków różnią się, profile smFRET nadal można opisać jako trzy nakładające się FRET gatunków o podobnych populacjach (dodatkowe Fig. S4). Na przykład, dla miejsc koniugacji 25 C/25 C, gatunki o wysokim, średnim i niskim progu są wyśrodkowane przy wydajności progu 0,68, 0,54 i 0,21, z odpowiednimi populacjami ~48%, ~43% i ~9% (dodatkowe rys. S4d). Tak więc, koniugacja fluoroforów jest mało prawdopodobne, aby zaburzyć strukturę białka, a pomiary smFRET wykazały nieodłączną dynamikę konformacyjną K48-diUb niezależnie od miejsca koniugacji, to znaczy, że K48-diUb zmienia się między trzema różnymi stanami w przypadku braku białka partnerskiego.

w celu dalszej oceny, czy podjednostki ub w dłuższym łańcuchu ub związanym z K48 również wahają się między wieloma stanami konformacyjnymi, przeanalizowaliśmy profil smFRET Tetra-ubikwityny związanej z K48 (K48-tetraUb). Połączyliśmy fluorofory w dwóch miejscach N25C w diubie dystalnym (z diubem proksymalnym) tetrauba K48. Profil smFRET może być również dopasowany jako trzy nakładające się na siebie gatunki progów (dodatkowe rys. S5a). Chociaż względne populacje tych trzech gatunków różnią się od izolowanych K48-diUb z fluoroforami sprzężonymi w tych samych miejscach (dodatkowa Fig. S4d), efektywność progów środkowych gatunków progów jest prawie identyczna. Tak więc Stany konformacyjne jednostki diUb są prawdopodobnie zachowane w dłuższym łańcuchu ub związanym z K48, podczas gdy różnica w populacjach względnych może być wynikiem efektu modulacyjnego proksymalnego diuba.

gatunki o wysokiej czułości są selektywnie wzbogacane przez Rpn13

aby ocenić związek między dynamiką konformacyjną łańcucha ub połączonego z K48 i rozpoznawaniem rpn13, miareczkowaliśmy 150 PM znakowanego fluoroforem K48-diUb z ludzkim białkiem rpn13 o Pełnej długości. Co ciekawe, po dodaniu 100 nM Rpn13, istniejące wcześniej gatunki K48-diUb o wysokich progach są wzbogacane od ~48% do ~57% (rys. 1a, b), natomiast populacja gatunków średnio – i niskopodłogowych maleje. Populacja gatunków o wysokich progach nadal rośnie wraz z dodaniem większej liczby Rpn13 (rys. 1C), a wiązanie izotermy można dopasować do wartości KD 119 ± 24 nM (rys. 1d).

wcześniej wykazano, że Rpn13NTD jest głównie odpowiedzialny za bindowanie Ub 6, 7. W ten sposób przeprowadziliśmy miareczkowanie smFRET dla 150 pM znakowanego fluoroforem K48-diUb przy użyciu tylko Rpn13NTD zawierającego tylko pierwsze 150 reszt. Rpn13NTD również selektywnie wzbogaca wysokoobrotowe gatunki K48-diUb(rys. 1e, f). Wzrost populacji gatunków o wysokich progach można dopasować do wartości KD wynoszącej 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), co jest około 4-krotnym wzrostem powinowactwa w porównaniu do pełnej długości Rpn13. Jeśli fluorofory są przyłączone w alternatywnych miejscach koniugacji (dodatkowe rys. S1B i S4B), miareczkowanie Rpn13NTD powoduje również wzbogacenie równoważnych gatunków progów zgodnie z podobną tendencją, uzyskując prawie identyczną wartość KD (dodatkowe rys. S6). Tak więc, wygląd dodatkowe pozostałości mogą mieć niewielki wpływ hamujący na interakcję między Rpn13NTD i K48-diUb.

ponadto wykonaliśmy miareczkowanie smFRET dla 150 pM K48-tetraUb z fluoroforami sprzężonymi na dystalnej diUb (dodatkowe rys. S5a). Miareczkowanie Rpn13NTD wybiórczo wzbogaca istniejące wcześniej gatunki o wysokim progu dystalnego diUb znakowanego fluoroforem(Fig. S5b-d), A izoterma wiązania może być zamontowana do wartości KD 214 ± 70 nM (rys. 1h). 7-krotne zmniejszenie powinowactwa wiązania w porównaniu do rpn13ntd: oddziaływanie K48-diUb można przypisać samoistnemu powiązaniu między diubem dystalnym i diubem proksymalnym 34, co zmniejsza dostępność powierzchni wiązania dla wiązania Rpn13. Co ważne, dla wszystkich miareczkowań smFRET K48-diUb lub K48-tetraUb, sprawność ośrodka gatunków o wysokim progu niewiele się zmienia przy braku lub obecności Rpn13 lub rpn13ntd. Oznacza to, że Rpn13 wiąże się z istniejącą konformacją K48-diUb poprzez mechanizm selekcji konformacyjnej, niezależnie od tego, czy K48-diUb jest sam w sobie, czy częścią dłuższego łańcucha Ub. Oznacza to również, że gatunek o wysokim stopniu progresji, tj. istniejący wcześniej stan zwarty K48-diUb, nie jest w pełni zamknięty i jest gotowy do interakcji z innymi białkami. Co ważne, selektywne wzbogacenie gatunków wysokogórskich wskazuje również, że Rpn13 powinien współdziałać z obiema podjednostkami Ub w tym samym czasie.

Rpn13 preferencyjnie wiąże się z diubem związanym z K48

aby ocenić swoistość wiązania rpn13 dla wiązania K48, oceniliśmy powinowactwo wiązania między rpn13 i innymi typami białek Ub. Przy miareczkowaniu 200 nM Rpn13NTD do 150 pM znakowanego fluoroforem K48-diUb, populacja gatunków o wysokim progu wzrasta o 15% z ~48% do ~63% (Fig. 1f). W tym stężeniu Wiązanie K48-diUb nie jest jeszcze nasycone Rpn13NTD (Fig. 1g) i w związku z tym populacja gatunków wysokogórskich jest wrażliwa na niewielkie zmiany dostępnego stężenia Rpn13NTD. Nieoznakowany K48-diUb może konkurować o wiązanie z Rpn13NTD z oznaczonym fluoroforem K48-diUb. Po dodaniu 150 PM nieoznakowanego K48-diUb, populacja gatunków o wysokich progach zmniejsza się o 7,5%, co odpowiada 50% hamowaniu K48-diUb związanego fluoroforem z wiązaniem rpn13ntd (Fig. 2A). Po dodaniu 300 PM unlabeled K48-diUb, populacja gatunków o wysokich progach zmniejsza się o 11%, co daje łącznie 73% zahamowania (rys. 2b). Jako takie, zarówno znakowany fluoroforem, jak i nie znakowany K48-diUb konkurują o ten sam interfejs wiązania na Rpn13 z podobnym powinowactwem wiązania. Oznacza to również, że koniugacja fluoroforów do K48-diUb powoduje niewielkie zakłócenia w interakcji między Rpn13NTD i K48-diUb.

A, B dodanie 200 nM Rpn13NTD najpierw wzbogaca wysokoobrotowe gatunki znakowanych fluoroforami K48-diUb(por. Rys. 1F), oraz dalsze dodawanie 150 pM i 300 pM nieoznaczonych K48-diUb zmniejsza populację gatunków wysokogórskich. c, D dodanie 150 pM i 300 pM nieoznakowanego monomeru Ub ma znikomy wpływ na populację gatunków wysokogórskich. E, f dodanie 150 pM K48-diUb i 150 pM M1-diUb powoduje bardzo mały spadek populacji gatunków o wysokich progach

ponadto do mieszaniny 200 nM Rpn13NTD i 150 pM znakowanej Fluoroforem K48-diUb, dodaliśmy nieoznakowany monomer Ub, diubiquitin połączoną z K63 lub diubiquitin połączoną z m1, aby ocenić, czy inne typy Ub mogą wyprzeć K48-diUb. Populacja wysokogórskich gatunków zmienia się niewiele z dodatkiem 150 pM lub 300 PM ub monomeru (rys. 2c, d). Po dodaniu 150 pM K63-diUb i 150 pM M1-diUb populacja gatunków o wysokich progach również pozostaje niezmieniona w zakresie błędów (rys. 2e, f). Z drugiej strony, bezpośrednie miareczkowanie 1 µM Rpn13NTD do sprzężonych fluoroforów K63-diUb i m1-diUb powoduje niewielką zmianę ich wcześniej istniejących profili smFRET(dodatkowe rys. S7). Razem Rpn13NTD selektywnie współdziała z K48-diUb.

struktura rozwiązania Rpn13NTD:Kompleks K48-diUb

chociaż wykazaliśmy, że Rpn13NTD selektywnie oddziałuje z K48-diUb, określono tylko złożoną strukturę między Rpn13NTD a monomerem ub 6,8. Aby zrozumieć, w jaki sposób dwie podjednostki w K48-diUb mogą jednocześnie oddziaływać z Rpn13NTD, postanowiliśmy określić strukturę rozwiązania kompleksu Rpn13ntd:K48-diUb przy użyciu jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Po utworzeniu kompleksu białkowego pozostałości międzyfazowe doświadczają innego środowiska lokalnego, a zatem wyświetlają sygnały NMR. Odkryliśmy, że miareczkowanie nieoznakowanego K48-diUb do znakowanego 15N rpn13 powoduje duże perturbacje przesunięcia chemicznego (CSP), które obejmują głównie pozostałości 73-83 i 93-106 (Fig . 3A). Pozostałości te tworzą przylegającą do siebie powierzchnię na Rpn13, obejmującą obszar większy niż oczekiwano z wcześniej wyznaczonej złożonej struktury między Rpn13NTD a monomerem ub 6,7. Z drugiej strony, miareczkowanie nieoznakowanego Rpn13NTD do K48-dUb, z proksymalnym lub dystalnym oznaczeniem Ub 15N i drugą podjednostką nieoznakowaną, CSP obserwuje się głównie dla pozostałości w regionie arkusza β obu podjednostek Ub. Niektóre pozostałości międzyfazowe również zniknęły po utworzeniu kompleksu (rys. 3b, c).

a-c CSP uśrednione przez 1h i 15N wymiary szkieletowych protonów amidowych po utworzeniu kompleksu z 0,2 mM znakowanymi izotopem i nie znakowanymi białkami. Wstawki: 15N znakowane podjednostka jest zilustrowany reprezentacji powierzchni, a czerwone kolorowe pozostałości mają CSP powyżej linii przerywanej. d, e za pomocą sondy paramagnetycznej sprzężonej w miejscu e24c dystalnego Ub, oceniono współczynniki intensywności między widmem paramagnetycznym i diamagnetycznym oraz wartości Pre Γ2 dla protonów amidowych szkieletu znakowanego 15N rpn13ntd. Szare skrzynki wskazywały na pozostałości o bardzo dużych PREs międzycząsteczkowych. f za pomocą paramagnetycznej sondy sprzężonej w miejscu n25c proksymalnego Ub zmierzono wartości Γ2 dla protonów amidowych znakowanego 15N dystalnego Ub w K48-diUb. Paski błędów wskazują 1 S. D., a pozostałości całkowicie poszerzone w kompleksie są oznaczone gwiazdami

Nuclear Overhauser effect (NOE) zgłasza zależność odległości (< 6 Å) między jądrami. Co więcej, eksperyment 13C z półfiltrowanym NMR może dostarczyć NOE między protonem związanym z 12C a protonem związanym z 13C, tj. międzycząsteczkową relacją odległości. Otrzymaliśmy międzycząsteczkowe NOEs między Rpn13NTD A ub proksymalnym, między Rpn13NTD A ub dystalnym oraz między ub proksymalnym A ub dystalnym (dodatkowe rys. S8). Ponadto, skoniugowaliśmy sondę paramagnetyczną maleimide-EDTA-Mn2 + w miejscu e24c dystalnego Ub i zebraliśmy paramagnetyczne wzmocnienie relaksacyjne (PRE) dla szkieletowych protonów amidowych Rpn13NTD, zgodnie z ustalonym protokołem 22,35. Jak oceniono albo przez stosunek intensywności szczytowej widm paramagnetycznych do diamagnetycznych, albo przez poprzeczne wzmocnienie relaksacyjne Γ2, pozostałości Rpn13 30-42 i 101-106 doświadczają dużych PREs z silnym poszerzeniem linii (Fig. 3d, e). Skoniugowaliśmy również sondę paramagnetyczną w miejscu n25c bliższego UB i oceniliśmy szybkość wzmocnienia relaksacji poprzecznej Γ2 dla dystalnego Ub (rys. 3f). Duże wartości PRE obserwuje się między dwiema podjednostkami ub wolnego od ligandów K48-diUb, a dodanie Rpn13NTD zwiększa inter-Ub PREs, ale o podobnym profilu PRE. Eksperymenty PRE NMR potwierdzają więc, że Rpn13NTD wzbogaca istniejący wcześniej stan zwarty K48-diUb.

Dopracować Rpn13NTD:K48-diub complex structure przeciwko eksperymentalnym ograniczeniom, wykonaliśmy sztywne dokowanie ciała z swobodą kąta skrętu nadaną pozostałościom linkera diUb i łańcuchom bocznym reszt międzyfazowych. Dla 20 konformerów o najniższej energii odchylenie pierwiastka średniego kwadratu (RMS)dla szkieletowych ciężkich atomów wszystkich sztywnych reszt wynosi 0,86 ± 0,54 Å (dodatkowe rys. S9 i tabela S1). Dwie podjednostki ub K48-diUb pozostają związane w kompleksie, grzebiąc powierzchnię dostępną rozpuszczalnikiem (SASA) ~1130 Å2. Z drugiej strony, Rpn13NTD klina się, zakopując ~940 Å2 SASA z bliższym UB i ~1300 Å2 SASA z dystalnym Ub (rys. 4a). Złożona struktura między Rpn13NTD i bliższym Ub K48-diUb w niniejszym badaniu jest podobna do znanej złożonej struktury między rpn13ntd i monomerem ub 6,7, z różnicą RMS dla ciężkich atomów szkieletu 2,17 ± 0,31 Å (dodatkowe rys. S10a). Co ciekawe, chociaż hydrofobowe pozostałości L8, I44 i V70 w proksymalnym Ub są zaangażowane w interakcję z Rpn13, te same trzy pozostałości w dystalnym Ub są zakopane w interfejsie Ub-Ub.

struktura Rpn13NTD: kompleks K48-diUb. Powstanie kompleksu powoduje powstanie rozległych interfejsów między podjednostkami. b powierzchnie potencjału elektrostatycznego Rpn13NTD i dystalnego Ub K48-diUb, narysowane w skali ± 3 kBT. Pozostałości R104 w Rpn13NTD i D39 w dystalnym Ub są pokazane jako kulki i pałeczki. c r104e mutacja odwracająca ładunek w Rpn13NTD powoduje 300-krotne zmniejszenie powinowactwa wiązania do K48-diUb, jak oceniono przez smFRET(por. Dodatkowe Rys. S11). Wartość KD jest zgłaszana jako najlepsze dopasowanie ± błędy dopasowania. d analizy Western blot pokazują, że transfekcja mutanta rpn13 r104e (z flagą N-terminala) zwiększa całkowitą ilość białek poliub związanych z K48 w komórce. odporność komórek e na szok cieplny (w stosunku do komórek bez szoku cieplnego) pokazuje, że transfekcja mutanta rpn13 r104e, ale nie dzikiego typu Rpn13, nadaje termotolerancję. *P < 0, 05, ** * P < 0.001, aby kontrolować komórki w tej samej grupie, niesparowany test t; ##P < 0,01, ###p < 0,001, do nieleczonych komórek z szokiem cieplnym, jednokierunkowa ANOVA; & & P < 0.01, &&&P < 0,001, do komórek transfekowanych dzikim typem Rpn13 z szokiem cieplnym, jednokierunkowa ANOVA

złożona struktura rpn13ntd: K48-diUb może być również potwierdzona przez jednocząsteczkowe dane progowe. Opierając się na złożonej strukturze, modelowaliśmy fluorofory w ich miejscach koniugacji w K48-diUb. Średnia odległość wynosi 43,2 ± 5.8 Å między geometrycznymi centrami fluoroforowych pierścieni aromatycznych, co odpowiada teoretycznej wydajności progu 0,73 ± 0,13 (dodatkowe rys. S10b). Wartość ta jest prawie taka sama jak wydajność centrum obserwowana dla gatunków o wysokich progach (Fig. 1a).

zakłócenie Rpn13NTD: dystalna interakcja ub powoduje akumulację ubikwitynowanych białek w komórce

w złożonej strukturze między Rpn13NTD i K48-diUb, interakcja między rpn13ntd a proksymalnym Ub jest podobna do interakcji między rpn13ntd a monomerem Ub, jak wcześniej opisano (dodatkowe rys. S10a). Tak więc zaprojektowaliśmy eksperymenty, aby ocenić funkcjonalne znaczenie dla interakcji między Rpn13NTD i dystalnym Ub K48-diUb. Wiele naładowanych pozostałości znajduje się na styku pomiędzy Rpn13NTD i dystalnym Ub K48-diUb, a zatem siła elektrostatyczna może odgrywać ważną rolę w stabilizacji kompleksu (rys. 4B). Wśród nich pozostałość D39 w dystalnym Ub jest zbliżona do pozostałości R104 w Rpn13. W ten sposób zmutowaliśmy rpn13 pozostałość R104 do glutaminianu i miareczkowaliśmy zmutowany rpn13ntd do znakowanego fluoroforem K48-diUb. Zmutowane białko wzbogaca wysokogatunkowe gatunki K48-diUb(dodatkowe rys. S11). Jednak powinowactwo wiązania staje się znacznie słabsze. Izoterma wiązania może być dopasowana do wartości KD 10,0 ± 3,3 µM, około 300 razy słabszej niż rpn13ntd typu dzikiego (rys. 4c). W związku z tym powiązanie z dystalnym Ub jest ważne dla specyficznego rozpoznania między Rpn13 a K48-diUb.

zmniejszone powinowactwo wiązania mutanta r104e pozwoliło nam ocenić funkcjonalne znaczenie interakcji między Rpn13 i łańcuchem ub związanym z K48. Przejściowa transfekcja rpn13 typu dzikiego nieznacznie zwiększa ilość białek poliub związanych z K48 (Fig. 4d). Możliwe jest, że po transfekcji Rpn13 nadmiar wolnego Rpn13 konkuruje o wiązanie z białkami poliub związanymi z K48 z Rpn13 związanym z proteasomem, co czyni rekrutację ubikwitynowanych białek substratowych do proteasomu mniej efektywną. Z drugiej strony, transfekcja mutanta rpn13 r104e znacznie zwiększa ilość białek poliub związanych z K48 w porównaniu do komórek transfekowanych rpn13 typu dzikiego (Fig . 4d). Jako pozytywną kontrolę inkubowaliśmy komórki z 1 µM MG132, silnym inhibitorem proteasomu36. Ze względu na zablokowanie degradacji białek labilnych, dodanie MG132 znacznie zwiększa ilość białek poliub związanych z K48. Łącznie, mutacja r104e rpn13 może prowadzić do akumulacji ubikwitynowanych białek substratowych. Można to przypisać słabszej interakcji pomiędzy mutantem rpn13 związanym z proteasomem a mutantem K48-diUb i K48-poyUb.

szok cieplny może zmniejszyć żywotność komórek. Odkryliśmy, że 30-minutowy szok cieplny w temperaturze 43 °C może zmniejszyć żywotność komórek HEK293 do 75%. Podobnie jak w poprzednich raportach36, 37, odkryliśmy również, że leczenie MG132 ma ochronny wpływ na przeżywalność komórek po szoku cieplnym, przy czym żywotność komórek zmniejszyła się do ~90% (rys. 4e). Dzieje się tak, ponieważ MG132 hamuje degradację proteasomalną, dzięki czemu krótko żyjące białka szoku cieplnego są bardziej dostępne (Fig. 4d). Zbadaliśmy również żywotność komórek wstrząśniętych Cieplnie transfekowanych dzikim typem Rpn13 i nie znaleźliśmy znaczącej różnicy w porównaniu z komórkami kontrolnymi bez transfekcji Rpn13. Z drugiej strony żywotność komórek transfekowanych Rpn13 r104e zmniejszyła się do ~83% po szoku cieplnym, co jest znacznie wyższe niż w przypadku komórek kontrolnych i komórek transfekowanych rpn13 typu dzikiego (Fig. 4e). Oznacza to, że zmutowany Rpn13 ma ochronny wpływ na przetrwanie komórek po szoku cieplnym, podobny do działania MG132. Łącznie, interakcja między Rpn13 i łańcuchem ub związanym z K48 jest niezbędna do rozpoznawania przez rpn13 ubikwitynowanych białek substratowych przez proteasom, podczas gdy mutacja punktu międzyfazowego w Rpn13 może powodować akumulację niektórych białek substratowych, takich jak białka szoku cieplnego, i nadawać termotolerancję transfekowanym komórkom.

rpn13ntd:interakcja K48-diUb może być ukierunkowana na modulowanie funkcji Rpn13

Rpn13 jest dynamicznie rekrutowany do proteasomu poprzez interakcję między Rpn13NTD A C-końcowym ogonem Rpn27,13. Złożona struktura wskazuje, że interfejs wiążący dla rpn13ntd dla Rpn2 jest bliski, ale nie pokrywa się z interfejsem wiążącym dla dystalnego Ub K48-diUb (rys. 5A). W ten sposób zmieszaliśmy ostatnie 16 pozostałości Rpn2 (Rpn2CTD) z Rpn13NTD lub z rpn13 pełnej długości w stosunku 1:1 i miareczkowaliśmy kompleks Rpn13NTD:rpn2ctd do znakowanego fluoroforem K48-diUb. Premiksowanie Rpn2CTD zwiększyło wartość KD Rpn13NTD: K48-diUb z 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) do 66,8 ± 13,9 nM (dodatkowe rys. S12a – C i Rys. 5b), podczas gdy zmniejszono wartość KD Rpn13: K48-diUb z 119 ± 24 nM (Fig. 1d) do 43,9 ± 12,8 nM (dodatkowe rys. S12d-f i Rys. 5c). Tak więc, zapewniając niepewność pomiaru, skojarzenie Rpn2CTD powoduje tylko niewielkie zakłócenia dla powinowactwa wiązania między Rpn13 i K48-diUb, co może mieć również związek z obecnością linkera i domeny C-końcowej Rpn13.

a powierzchnia wiążąca dystalnego Ub K48-diUb na Rpn13NTD przylega do powierzchni wiążącej Rpn2CTD. Ze złożoną strukturą rpn13ntd-rpn2ctd (kod PDB 5v1y) nałożoną przez Rpn13NTD, Rpn2CTD jest pokazany jako czerwony rysunek. Pozostałość Rpn13 K34 znajduje się blisko C-końca dystalnego Ub (pokazanego jako linia przerywana). powinowactwo wiązania b, c uzyskano z miareczkowania smfret równomiernego Rpn13NTD:Rpn2CTD lub Rpn13: Rpn2CTD do znakowanego fluoroforem K48-diUb. Wartości KD są zgłaszane jako najlepsze dopasowanie ± błędy dopasowania. Wiązanie d zakotwiczonego w Rpn2 monomeru ub prawdopodobnie zajmuje tę samą powierzchnię wiązania dystalnego Ub, powodując przemieszczenie tego ostatniego. e, f eksperymenty konkursowe smFRET, z dalszym dodawaniem 150 pM białka fuzyjnego Rpn2CTD-Ub, do mieszaniny 200 nM Rpn13NTD lub pełnej długości Rpn13 i 150 pM znakowanego fluoroforem K48-diUb (c. f. Fig. 1C i f). Błąd wskazuje 1 S. D. z trzech niezależnych pomiarów populacji gatunku smFRET

Rpn2 i dystalny Ub K48-diUb zajmują pobliskie powierzchnie na Rpn13NTD. Dlatego białko fuzyjne z monomerem Ub dołączonym na końcu C Rpn2CTD może wystawać i zakłócać interakcję między Rpn13NTD z dystalnym Ub K48-diUb(Fig . 5d). Jak pokazaliśmy, dodanie 200 nM Rpn13NTD zwiększa populację gatunków o wysokim progu 150 PM znakowanych Fluoroforem K48-diUb do ~63% (rys. 1F), podczas gdy dodanie monomeru Ub nie może konkurować o Wiązanie Rpn13NTD (rys. 2c, d). Kiedy dodaliśmy dodatkowe 150 PM nieoznakowane białko fuzyjne Rpn2CTD-Ub, populacja gatunków o wysokich progach zmniejsza się o ~4% do ~59% (rys. 5e). Z drugiej strony wykazaliśmy, że dodanie 200 nM pełnej długości Rpn13 zwiększa populację gatunków o wysokiej progi 150 pM znakowanych Fluoroforem K48-diUb do ~60% (rys. 1c). Dalsze dodawanie 150 PM nieoznakowanego białka fuzyjnego Rpn2CTD-Ub zmniejsza populację gatunków o wysokich progach o ~4,5 do ~55,5% (rys. 5f). Należy zauważyć, że dołączenie Ub w Rpn2CTD nie ma prawie żadnego wpływu na interakcję między Rpn2CTD i Rpn13NTD(dodatkowe rys. S13). Tak więc, nasze dane wskazują, że interfejsy rpn2 i K48-diUb binding na Rpn13NTD są blisko siebie. Co ważniejsze, ub zakotwiczony w Rpn2 może fizycznie zablokować dostęp dystalnego diuba do Rpn13 i osłabić interakcję między K48-diUb i Rpn13.