Abstract
John Gurdon är en framstående gruppledare i Wellcome Trust / Cancer Research UK Gurdon Institute och Professor Emeritus vid Institutionen för zoologi vid University of Cambridge. År 2012 tilldelades han Nobelpriset i fysiologi eller medicin tillsammans med Shinya Yamanaka för arbete med omprogrammering av mogna celler till pluripotency, och hans laboratorium fortsätter att undersöka molekylära mekanismer för nukleär omprogrammering av oocyter och ägg. Vi träffade John i hans Cambridge kontor för att diskutera sin karriär och höra hans tankar om det förflutna, nutid och framtid omprogrammering.
ditt första papper publicerades 1954 och berörde inte embryologi utan entomologi. Hur kom det till?
Tja, det tidiga papperet publicerades i Entomologens månadstidning. Under hela mitt tidiga liv var jag verkligen intresserad av insekter och brukade samla fjärilar och Malar. När jag var en grundutbildning jag gillade att ta ledigt och gå ut till Wytham Woods nära Oxford för att se vad jag kunde hitta. Så jag gick ut en kall vårdag och det fanns inga fjärilar eller några malar, men från ingenstans fanns det en fluga – jag fångade den, lade den i min flaska och tittade på den. Det första som var uppenbart var att det inte var en fluga, det var en hymenopteran, men när jag försökte identifiera den kunde jag helt enkelt inte räkna ut vad det var. Jag gillar inte att bli besegrad, så jag gick till Hope-avdelningen i Oxford och de visste inte heller vad det var, och sedan till Natural History Museum, där en kurator berättade för mig att det, otroligt nog, var en art som aldrig registrerats i England tidigare! Detta var intensivt irriterande för Entomologiavdelningen i Oxford eftersom professorn vid den tiden hade en stor ekologisk studie av alla insekter i dessa skogar, och här var en student som just hade fångat det första han kunde hitta och plockade upp en ny art. Så jag skrev ett par stycken som meddelade upptäckten, och det var så jag kom att få det papperet.
och behöll du ditt intresse för insekter?
inte riktigt på ett riktigt vetenskapligt sätt, även om jag fortsätter att tänka att jag skulle vilja gå tillbaka till det, främst för att lepidopterans färgmönster är så anmärkningsvärda. Vi vet verkligen nästan ingenting om hur färgmönster bildas – i någon art. Du kommer inte att ha en gen som sätter en fläck på en vinge, det är en mer komplicerad process, inklusive diffusion av molekyler. Jag fortsätter att tänka att när jag faktiskt går i pension tar jag upp det, men jag har ännu inte kommit till den punkten!
för ett halvt sekel sedan startade du dina kärnkraftsöverföringsexperiment, och idag publicerar ditt laboratorium fortfarande på det. Varför tror du att ett sådant konceptuellt enkelt experiment har haft en så anmärkningsvärt lång hållbarhetstid?
när jag gjorde de tidiga kärnkraftsöverföringsexperimenten – och jag är permanent tacksam mot min handledare, Michael Fischberg, för att jag satte mig på det arbetet-var frågan då om alla celler i kroppen har samma gener. Ett sätt att bestämma detta var att ta en kärna från en typ av cell, lägga den i ägget och se om den kan utvecklas. Detta experiment var tänkt så långt tillbaka som i slutet av 19-talet: det finns ett papper av en man vid namn Rauber som beskriver ett experiment för att sätta en padda kärna i en groda ägg, och helt enkelt säger att han inte få ett resultat, så det är inte klart om han gjorde experimentet eller inte!
hur som helst, på 1950-talet utvecklade Briggs och King, två amerikaner, tekniken för att transplantera kärnan, och Fischberg bestämde att vi skulle prova detta i Xenopus. Det fanns flera mycket besvärliga tekniska svårigheter som vi så småningom övervann – lika mycket av tur som skicklighet – och slutresultatet var att du kan få väsentligen normal utveckling genom att ta kärnan i en specialiserad cell, i detta fall en tarmcell, och transplantera den till ett enukleerat ägg. Det säger tydligt att samma gener finns i alla olika typer av celler.
och sedan fanns det detta gap på 50 år innan Yamanaka utvecklade den inducerade pluripotenta stamcellstekniken, som verkligen öppnade fältet för användbar klinisk potential. Grodexperimenten (och mycket efterföljande arbete, inklusive genereringen av Dolly fåren på 1990-talet) sa att du kan vända eller föryngra en specialiserad kärna tillbaka till början igen, men klinisk översättning blev en realistisk möjlighet hos människor först när Yamanaka visade att du inte behövde skaffa mänskliga ägg eller embryon för att göra stamceller. Den här tanken att du skulle kunna härleda nya celler av ett slag som börjar med vuxna celler av en helt annan typ uppenbarligen chimed med vårt arbete från ett halvt sekel i förväg men intressant nog var det absolut inte uppenbart när dessa tidiga experiment gjordes. ’Omprogrammering’ var inte ens syftet med experimenten. Jag antar att jag inte skulle få stöd för att genomföra dessa kärnöverföringsexperiment idag om det inte var för deras relevans för omprogrammering hos människor.
så då är frågan Hur fungerar den här processen? Vad ligger till grund för äggets förmåga att föryngra en kärna? Vi var alltid intresserade av den frågan, men det blev alltmer intressant med Yamanakas experiment. Och jag vill påpeka att människor fortfarande inte riktigt vet varför Yamanaka – förfarandet fungerar-även efter tio år förstår de inte riktigt mekanismen. Så vi anser, och det är sant, att ägget gör ett ganska bättre jobb med att vända differentiering jämfört med överuttryckande transkriptionsfaktorer, och tror därför att om du visste vad alla äggkomponenter är och visste hur man får dem att byta ut med de somatiska, skulle du inte behöva Yamanaka-faktorerna. Det är därför vi aktivt bedriver mekanismen för omprogrammering av ägget, med samma procedur som gjordes för 60 år sedan, men med en hel del nya sätt att undersöka det. För mig exemplifierar detta den intressanta principen att arbete som utfördes på en gång kan ha en efterföljande, mycket större relevans mot bakgrund av senare framsteg.
vi bedriver aktivt mekanismen för omprogrammering av ägget, med samma procedur som gjordes för 60 år sedan, men med en hel del nya sätt att undersöka det
och vad är din nuvarande förståelse för molekylära mekanismer för omprogrammering av ägget?
det beror nästan säkert på en hög koncentration i ägget av kromatinkomponenter, särskilt histoner. Det finns många varianter av histoner, när det gäller hur de modifieras, och en hel del av vårt senaste arbete har beskrivit histonförändringarna som införs av ägget på en inkommande kärna. Denna kromatinförändring är kanske det första nyckelstadiet-det finns en viss histonvariant närvarande i ägg vilket är mycket viktigt, och det är troligt att ersättning av vuxna kromatinkomponenter med de som finns i ägget är i slutändan det som hjälper till att orsaka förändringen.
det finns två aspekter på detta problem. En är hur använder ägget sina komponenter för att ersätta de i den somatiska kärnan, och så föryngra det? Den andra är varför fungerar inte omprogrammering perfekt? Jag gillar att illustrera det så här: det finns en strid mellan ägget, försöker vända allt tillbaka till ett embryonalt tillstånd och den somatiska kärnan, som är utformad för att vara exakt motsatsen – det är tänkt att inte förändras. De flesta av våra celler förändras inte, och det är ganska viktigt att cellerna är utomordentligt stabila. Så ägget försöker åsidosätta kärnan, och kärnan försöker motstå den; det är de två kompletterande delarna av vårt forskningsprojekt just nu.
för att komplettera detta tittar vi också på de förändringar som uppstår i en spermkärna som gör det så anmärkningsvärt mottagligt för omprogrammering; i slutändan skulle vi vilja konvertera den somatiska kärnan till samma tillstånd som spermierna, och då bör omprogrammering fungera mycket bra.
medan jag tror att de flesta läsare kommer att känna till dina omprogrammeringsexperiment, skulle jag vilja diskutera några av dina andra arbeten. I en serie artiklar på 1970-talet studerade du översättningen av injicerat RNA i grodaocyter: kan du berätta lite om detta arbete?
experimentet som tilltalade mig enormt vid den tiden, och fortfarande gör det, är att injicera messenger RNA (mRNA) i ägg. Jag gjorde detta arbete när människor, särskilt Hubert Chantrenne i Belgien, först hade isolerat mRNA. Jag var en god vän till en underbar man vid namn Jean Brachet och sa till honom att det jag verkligen skulle vilja göra är att transplantera inte kärnor utan mRNA i ägg. Han gav mig en introduktion till Chantrenne, som gjorde rabbit globin RNA och gav oss några, tack vare Brachet. Sakerna var kända för att vara extremt RNase känsliga, så du var nästan tvungen att ta ett bad i kromsyra innan du rörde någonting! Nu hade jag föreslagit det experimentet som ett bidrag skulle det ha avvisats eftersom ägget var känt för att vara fullt av ribonukleaser: att sätta känsligt mRNA i en ribonukleisk miljö skulle inte ge någon mening. Ändå fungerade det, och förvånansvärt bra – globin-meddelandet gick in i ägg, och när äggen hade förvandlats till grodyngel gjordes fortfarande kaninglobin. Nästan säkert är orsaken till framgången att mikroinjektion inte öppnar lysosomerna, där ribonukleaserna är uppdelade. Så det finns en annan intressant princip: när någon säger att något inte fungerar är det mycket bättre att prova det än att ta sitt ord för det. Och mRNA-injektion har visat sig vara ett mycket användbart tillvägagångssätt för alla möjliga frågor. Dessa RNA-experiment var verkligen ett derivat av de tekniska resultaten av kärnöverföring – om det fungerar för kärnor, vad mer kan du överföra? Eddy De Robertis och jag hade till och med ett papper som kallade Xenopus-ägget ett levande provrör.
du var också intresserad av induktionsprocessen och identifierade en ’samhällseffekt’ vid induktionen av Xenopus mesoderm. Vad är grunden för denna effekt?
i många årtionden hade människor transplanterat vävnad-ta en bit vävnad och ympa den på en annan värd. Men vävnaden är uppenbarligen sammansatt av många celler, som kanske inte alla är desamma, och för mig var det alltid önskvärt att göra en encellig transplantation. Och så gjorde jag många av dem, flyttade enskilda stamceller från en del av embryot till en annan, men jag kunde aldrig få det att fungera – cellerna dog alltid. Det måste ha funnits någon anledning till att du framgångsrikt kan transplantera flera celler men inte enskilda celler. Det ledde mig att utföra injektioner av mindre och mindre antal celler. Det visade sig att transplanterade celler släpper ut utsöndrade molekyler – signaleringsproteiner till exempel – som är nödvändiga för att de ska göra någonting i värden. En enda cell har svårt att göra mycket med vad den utsöndrar-koncentrationen är för låg – men flera celler kommer att bygga upp en tillräckligt hög koncentration för att faktiskt fungera. Denna ’samhällseffekt’ är något analog med kvorumavkänningen som identifierats i bakterier.
Vad är ditt perspektiv på var utvecklingsbiologi som Fält är idag? Vad är luckorna i vår förståelse, och vad behöver vi göra för att fylla luckorna?
min egen syn på utveckling är att man måste försöka begränsa saker till enskilda enheter, oavsett om det är en cell eller en kärna eller en molekyl, och jag är ofta förlöjligad eftersom jag alltid frågar folk vilken koncentration deras molekyl är på, och de kommer att säga att det inte spelar någon roll.
jag skulle säga att koncentration och tid är de två kritiska sakerna i utvecklingen. Du måste veta koncentrationen, och du måste veta hur länge det måste vara där för att göra skillnad – för celler kan en viss koncentration av en molekyl i några sekunder inte vara densamma som den koncentrationen i 10 minuter. Så jag anser att det vi verkligen saknar i utvecklingsbiologi för tillfället är någon förmåga att bestämma koncentrationen av proteiner, analogt med mätningen av nukleinsyror med PCR.
i min egen erfarenhet blev jag involverad i experiment på ett protein som heter Activin, en TGF-Bisexuell molekyl. Ganska otroligt – och jag gillar fortfarande det här experimentet – du kan ta blastula-celler, helt dissociera dem i suspension och sedan lägga till Activin vid en känd koncentration under en känd tid. Sedan tvättar du cellerna och låter dem reagera och frågar hur de skiljer sig åt. Det visade sig att resultatet – om dessa celler gjorde ectoderm, mesoderm eller endoderm – berodde inte bara på mängden aktivin utan också på den tid du badade cellerna i den. Det var en intressant princip att koncentration och tid kan ha helt olika effekter beroende på vilken du ändrar och hur mycket.
men för att verkligen förstå fantastiska fenomen som detta in vivo, att veta koncentrationen av proteiner kommer verkligen att vara viktigt, och jag tror att vi helt saknar det just nu. I framtiden kommer vi gradvis att arbeta med enstaka celler, kända koncentrationer, kända mängder tid, och då kan vi få en förståelse för vad som händer i dessa differentieringshändelser.
koncentration och tid är de två kritiska sakerna i utvecklingen
ditt arbete kommer förmodligen att vara mest kliniskt inflytelserikt inom cellbyte – vad tycker du om de nuvarande utmaningarna och utsikterna?
jag tror att utsikterna för cellbyte är mycket bra, men vetenskapliga framsteg kan hindras av andra saker. Exemplet jag ofta använder är åldersrelaterad makuladegeneration, där fotoreceptorerna dör och så blir du blind. Dessa fotoreceptorer stöds av retinala pigmenterade epitelceller, och forskare i London och på andra håll kan använda Yamanaka-proceduren för att göra tunna lager av epitelcellerna och sedan sätta in dem i ögat genom en process som inte är mer komplicerad än linsbyte. När jag pratar om detta kommer folk fram till mig och frågar när de kan få det gjort. Svaret är att de inte får, och anledningen enligt min mening går i slutändan tillbaka till juridiska frågor. Om något går fel kommer advokaterna att kämpa för enorma kompensationsbelopp. Om du gör proceduren hundra gånger, och det går fel en gång – nittionio personer kommer att vinna enormt i att inte bli blinda, men man kommer att få en så stor ekonomisk utmärkelse att läkaryrket kommer att blyga bort från det. Jag tror att detta är en verklig utmaning för fältet – läkaryrkets motstånd på grund av potentiella juridiska och ekonomiska konsekvenser.
du har tidigare pratat om vikten av vägledningen din doktorand, Michael Fischberg, och många av dina adepter har pratat om dig som en bra mentor. Vad är Gurdon – stilen för ledarskap?
Tja, jag skulle vara mycket självkritisk här – jag sätter mig inte ner med alla en timme i veckan för att gå igenom deras resultat, jag väntar bara tills jag ser dem över kaffe och frågar hur det går. Så jag måste vara en fruktansvärt dålig mentor i den meningen att jag inte riktigt gör en regelbunden och metodisk kontroll av saker. Men jag gillar att tro att människor kommer att få något bara från vanliga samtal. Någon som Doug Melton var en riktigt fantastisk kollega, men det var allt genom sin egen förmåga – jag kan inte tänka vad han fick från mig! Jag försöker helt enkelt övertyga människor som kommer in i mitt labb för att arbeta med ett värdefullt projekt och sedan låta dem njuta av det.
jag ska bara kommentera att Michael Fischberg verkligen var en anmärkningsvärd och generös mentor. Han satte mig på detta kärnkraftsöverföringsarbete och berättade för mig att jag skulle försöka vad jag ville, och var extremt stödjande. Det allra första dokumentet om kärnöverföring – han gjorde inte experimenten, men han var en författare på det, och med rätta. Men efter det, nästan till min förlägenhet, sa han’du tar endodermcellerna, jag tar resten’. Och så var han inte författare på de ytterligare tidningarna – det var anmärkningsvärt generöst, verkligen.
jag hade planerat att fråga om du fortfarande är ansluten till labbbänken, men jag fick mitt svar när jag kom till ditt kontor idag när du bytte media för en sats Xenopusägg. Är det viktigt för dig att upprätthålla denna anslutning?
jag har alltid behållit mitt labbarbete, även när jag gjorde andra saker också, och undervisar fortfarande kärnöverföring till mina kollegor. Denna koppling till bänken är naturligtvis inte realistisk för alla, men jag tycker om att genom att göra det upptäcker du ibland saker som kanske inte är uppenbara. Det är ingen mening med mig att använda PCR-maskiner eller den typen av saker, och en av mina kollegor för tillfället kör en western blot för mig. Men det labbarbete jag gör nu är mer beroende av att försöka hitta sätt att få dessa celler att göra vad jag vill att de ska göra – och det här är något jag vet väl.
har Nobelpriset förändrat ditt liv märkbart?
Jo ja, i den meningen att jag får en löjlig mängd inbjudningar, som körs nu på cirka 200 per år. Du kan inte börja hantera det – jag reser mindre än jag brukade, och jag är ganska selektiv om vad jag accepterar. Jag får många inbjudningar inte för mitt vetenskapliga bidrag utan snarare för min skolrapport, där min biologimästare skrev att jag inte skulle ha någon chans att lyckas som forskare, och som är inramad ovanför mitt skrivbord. Den historien gjorde uppenbarligen också ett stort intryck.
det finns också erkännande av allmänheten. Mycket snart efter att Nobelpriset blev känt råkade jag vara i Sydkorea. Promenader längs gatan, någon stoppade mig och frågade om jag var Dr Gurdon, och berättade mitt fotografi var i tidningen. Det var ganska anmärkningsvärt verkligen, täckningen som priset fick. Det är också självklart trevligt för människor att uppskatta mitt arbete, och Yamanakas, och att folk pratade om omprogrammering.
finns det något som Utvecklingsläsare skulle bli förvånad över att ta reda på om dig?
jag anser att det är viktigt att hålla sig i form och frisk. Jag har alltid hållit ett intresse för olika sportaktiviteter, framför allt skidåkning, skridskoåkning och squash, som var mina stora aktiviteter, även om jag har vänt de senaste åren till tennis från squash.
men jag antar att det som kan överraska läsarna är att jag är en komplett icke-intellektuell. Jag läser bara inte böcker, jag hatar att läsa, och jag går inte heller på teatern. Om jag blir frågad varför jag inte tycker om att läsa, säger jag att det tar lång tid, det är mycket lättare att prata med någon som har läst boken och be om bottenlinjen! Jag är inte intresserad av fiktion, det är bara inte för mig. Så jag är verkligen den ultimata icke-intellektuella.
