med hjälp av DBE-tekniken samlade vi systematiskt biopsier från hela människans tarmkanal och karakteriserade fördelningen av enteroendokrina K-och L-celler och uttrycket av deras hormonella produkter hos friska individer och individer med typ 2-diabetes.
eftersom typ 2-diabetes innebär övervikt/fetma och dysfunktionell glukoshomeostas som kan korrelera med förändringar i enteroendokrina K-och L-celler, var studien utformad för att beskriva fördelningsmönstret för dessa celler och uttrycket av några av deras produkter i de två prospektivt rekryterade, lika stora, väldefinierade och matchade grupperna av volontärer utan några kända gastrointestinala störningar. Med användning av DBE var det möjligt att erhålla ett stort antal prover i hela tarmkanalen: från nio anatomiskt specifika regioner (Fig. 1) och 7-22 ’stationer’ längs jejunum och ileum. Biopsierna från de anatomiskt väldefinierade områdena var mycket jämförbara. Större osäkerhet finns när det gäller biopsiplatser i jejunum och proximal ileum (biopsiplatser 3-9, Fig. 1) på grund av intubationens varierande längd och därmed antalet prover som erhållits mellan individer. För att hantera denna fråga delade vi systematiskt jejunum och ileum i sju regioner (se metoder). Det submukosala bläckmärket placerat vid maximalt införingsdjup under anterograd enteroskopi sågs under retrograd enteroskopi hos fyra av 24 individer, vilket indikerar total enteroskopi (Fig. 2). Det antas att majoriteten av tarmkanalen undersöktes i resten av deltagarna enligt bedömningen av längden på den uppnådda intubationen (för detaljer, se vårt metoddokument ).
vi använde immunhistokemi och cellantal för att kvantifiera enteroendokrina celler och prohormonbehandlingsenzymer och qPCR mRNA-expressionsanalys för att utvärdera hormonella/enzymatiska produkter. Båda metoderna är väl etablerade men utgör också begränsningar. En hög specificitet av antikroppar som används i immunhistokemi är av stor betydelse för att säkerställa ett minimum av ospecifik färgning (falska positiva). Därför valde vi antikroppar som är väletablerade och väl karakteriserade . Med hjälp av immunhistokemi och cellantal från mikrofotografier av skivade biopsier utvärderas tredimensionella objekt (dvs. enteroendokrina celler) med en tvådimensionell bildteknik. En mer optimal teknik för utvärdering av cellfördelning skulle vara stereologi, där den verkliga densiteten (dvs. celler/mm3-vävnad) uppskattas . Denna teknik skulle emellertid kräva fullständiga tvärgående’ block ’ av vävnad, vilket är oförenligt med det stora antalet biopsiställen, och därmed detaljerad kartläggning av tarmkanalen hos levande människor som syftade till i den aktuella studien. Dessutom bör följande beaktas. För det första indikerar utvärdering av mRNA-uttryck aktiviteten hos endokrina celler men ger inte ett mått på den totala produktionen av en viss cellprodukt eftersom inte allt mRNA översätts till en slutlig aktiv produkt. För det andra är uttrycket relativt eftersom de specifika mRNA-transkripten är relaterade till uttrycket av en stabilt uttryckt gen (se ESM-metoder för ytterligare detaljer). Med tanke på den biologiska heterogeniteten hos typ 2-diabetes kunde mer uttalade skillnader potentiellt ha upptäckts med en större provstorlek och inkludering av patienter med mer omfattande glukosdysreglering.
arbetet av SJ Exceptlund et al från 1983 om fördelningen av enteroendokrina celler är den mest detaljerade som hittills utförts i människans tarm med hjälp av IHS med ett brett spektrum av antisera (25 typer) mot kända eller föreslagna neurohormonala peptider i tarmen . Minimalt invasiva tekniker var inte tillgängliga vid den tiden. Följaktligen hämtades prover från endast sju regioner: proximal och distal duodenum, mid-jejunum, distal ileum, stigande kolon, distal del av tvärgående kolon eller sigmoid kolon och rektum. För varje region erhölls vävnadsmaterial från 9-17 individer. Proverna hämtades antingen under bukoperationer (främst på grund av malignitet) eller under enteroskopiska undersökningar med biopsier hos individer med andra gastrointestinala störningar, inklusive en mängd ospecificerade symtom och sjukdomar (t.ex. ockult blödning och leversjukdom). 1985 använde Adrian et al en radioimmunoassay teknik för att bestämma mängden PYY i gastrisk fundus och antrum, duodenum, jejunum, ileum, stigande kolon, sigmoid kolon och rektum . Prover från varje plats erhölls från 5-8 individer som genomgick operation på grund av karcinom eller magsår. 1992 rapporterades en studie som undersökte fördelningen av enteroendokrina L-celler hos människor av Eissele et al . Prover erhölls från sju regioner: duodenum, proximal och distal jejunum, ileum, stigande kolon, tvärgående kolon och rektum. Proverna erhölls från endast fem deltagare som genomgick operation för karcinom eller Crohns sjukdom. År 2005 undersökte Guedes et al fördelningen av GIP-, GLP-1 – respektive CgA-positiva celler med användning av IHS på prover från varje 20 cm av tunntarmen i 30 mänskliga kadaver .
det bör betonas att de fyra ovan nämnda studierna undersökte normalt förekommande vävnadsprover utan tecken på patologiska förändringar. Närvaron av maligna eller inflammatoriska förändringar i tarmområdet eller den snabba inledningen av cellnedbrytning efter mortem kunde emellertid ha påverkat den allmänna enteroendokrina cellfördelningen och funktionen. Dessutom kan deltagarnas heterogenitet ha påverkat resultaten.
i överensstämmelse med våra resultat, sj Acubilund et al, Eissele et al, Adrian et al och Guedes et al, respektive, beskrev variation i L-cellprodukter (GLP-1 och/eller PYY) beroende på tarmlokalisering, med en högre densitet/mängd i distal jejunum och ileum jämfört med duodenum och proximal jejunum , och en ökande densitet/mängd från proximal till distal kolon, med de högsta nivåerna i ändtarmen . Våra resultat stöder detta l-cellfördelningsmönster hos friska individer och i typ 2-diabetes, med ökande GCG-och PYY-genuttryck, liksom ökande densitet av GLP-1 och PYY-positiva celler, längs tunntarmen och längs tjocktarmen. Vi observerade också den största signalen av L-cellmarkörer (PYY – och GLP-1-positiva celler och PYY mRNA-uttryck) i ändtarmen, förutom uttrycket av GCG. Konsekvenserna-om några-av de observerade skillnaderna mellan grupper (signifikant större GCG och PYY-uttryck i kolon av deltagare med typ 2-diabetes jämfört med friska individer) är för närvarande okända. Det är väl etablerat att inkretineffekten reduceras vid typ 2-diabetes, och det har föreslagits att en defekt i näringsinducerad GLP-1-utsöndring kan bidra till att förklara detta fenomen. Studier som undersöker GLP-1-Svar på näringsstimuli hos personer med typ 2-diabetes och icke-diabetiska individer har dock visat att individer med typ 2-diabetes i allmänhet inte uppvisar reducerade plasma totala GLP-1-Svar .
vi observerade en skillnad mellan GCG-uttrycksnivåer och densitet av GLP-1-positiva celler längs tarmen. Detta betonar att L-celler i en del av tunntarmen kan bete sig annorlunda än enteroendokrina L-celler i en annan del av tunntarmen, vilket föreslagits av Svendsen et al, som observerade att utsöndringsmönstret för L-celler förändras längs mag-tarmkanalen hos råttor, dvs att L-celler utsöndrar olika förhållanden mellan PYY och GLP-1, med viss utsöndring endast GLP-1 . I linje med dessa fynd är det troligt att mer distalt belägna L-celler uttrycker proglukagon i högre utsträckning än mer proximalt belägna L-celler.
våra resultat av större GIP-uttryck och densitet av GIP-positiva celler i den proximala delen av tunntarmen, som båda minskar distalt till ileocaecal regionen hos friska individer och de med typ 2-diabetes, är i linje med tidigare resultat . Till skillnad från sj Ubiklund et al, som fann GIP-positiva celler att vara frånvarande från tjocktarmen, kunde vi upptäcka låga nivåer av GIP-positiva celler i den distala delen av tarmkanalen. Vi kan dock inte utesluta att detta är ett resultat av ospecifik antikroppsbindning. Vi observerade emellertid mRNA-uttryck av GIP i kolon i båda grupperna, om än på mycket låga nivåer. Uttrycket av GIP var signifikant större hos individer med typ 2-diabetes längs hela tarmkanalen. Det kan spekuleras att transkriptionen av GIP ökas som ett kompensationsresultat av GIP-resistens, dvs den reducerade insulinotropa effekten av GIP observerad hos individer med typ 2-diabetes . I linje med detta har fastande GIP-nivåer visats vara högre hos deltagare med typ 2-diabetes jämfört med icke-diabetiska kontrolldeltagare, och dessutom har det föreslagits att GIP bidrar till hyperglykemi som ses vid typ 2-diabetes (främst på grund av den glukagonotropa effekten av GIP) . Data om GIP-svar efter oral glukos eller blandade måltider hos individer med typ 2-diabetes har emellertid varit inkonsekventa, och en systematisk granskning med metaanalys har föreslagit att postprandiala GIP-svar är likartade hos dem med typ 2-diabetes och friska individer .
med tanke på att det sura glykoproteinet CgA är en komponent i cellvesiklar och anses spela flera roller i sekretoriska processen för endokrina produkter, används den som en allmän markör för enteroendokrina celler . Till skillnad från Guedes et al som observerade en konstant densitet av CgA-positiva celler längs tunntarmen, visade vår studie en signifikant nedgång. Dessutom observerade vi en större densitet av CgA-positiva celler i tunntarmen hos friska individer än deltagare med typ 2-diabetes. Det kan spekuleras att det totala antalet CgA-positiva celler (enteroendokrina celler) förändras vid typ 2—diabetes-antingen som en följd av typ 2-diabetestillståndet eller kanske bidrar till patogenesen av typ 2-diabetes. Vi observerade ganska höga antal CgA-positiva celler i rektum i båda grupperna. Nyligen visade Engelstoft et al hos möss att CgA huvudsakligen lokaliserades till monoaminutsöndrande enteroendokrina celler och mer glest till peptidutsöndrande enteroendokrina celler , kanske stöder förslaget från sj Exceptlund et al att de rektala enteroendokrina cellerna kunde ha en primärt lokal (parakrin) funktion snarare än systemisk funktion .
eftersom PC1 / 3 är känt för att bearbeta prohormoner som leder till bildning av GIP respektive GLP-1, förväntade vi oss att hitta närvaron av PC1/3 längs hela tarmkanalen. Vi observerade respektive en skillnad som involverade större uttryck av PCSK1/3 och lägre densiteter av PC1/3-positiva celler i tunntarmen hos deltagare med typ 2-diabetes jämfört med friska deltagare. Som beskrivits ovan bör detta resultat tolkas med tanke på att vissa enteroendokrina celler kan vara mycket aktiva i vissa regioner och ha låg aktivitet i andra regioner.
eftersom PC2 främst är känt för bearbetning av proglukagon till glukagon i pankreatiska alfaceller, var det intressant att hitta mRNA-uttryck av PCSK2 och PC2-positiva celler längs hela tarmkanalen. Detta kan indikera att glukagon produceras i tarmen, som nyligen föreslagits av Lund et al . I linje med detta kan det spekuleras att det större PCSK2-uttrycket i tunntarmen hos individer med typ 2-diabetes leder till bildning av överskott av glukagon, vilket bidrar till typ 2-diabetisk hyperglukagonemi. För att ytterligare klargöra denna aspekt är studier inklusive immunhistokemisk dubbelfärgning motiverade.
Sammanfattningsvis ger den nuvarande kartläggningen av fördelningen av enteroendokrina K-och L-celler och de observerade variationerna i uttrycksnivåer av deras relaterade produkter längs människans tarmkanal, i kombination med de påvisade skillnaderna mellan deltagare med typ 2-diabetes och friska individer, ett referensarbete för forskare och kliniker. Kombinerat med kunskap från fysiologiska studier om cirkulerande tarmhormoner kan våra data vara av värde för att förstå hur tarmen bidrar till att reglera glukosmetabolism och aptit. Identifiering av PC2 i enteroendokrina celler är intressant eftersom detta kan överensstämma med bildandet av glukagon i människans tarm. Men ytterligare studier behövs för att bevisa denna möjlighet och länka våra resultat till patofysiologin av typ 2-diabetes.
