funktionell Profilutvärdering av Lactobacillus fermentum TCUESC01: en ny potentiell probiotisk stam isolerad under Kakaofermentering

Abstrakt

användningen av intestinala probiotiska bakterier är mycket vanligt inom livsmedelsindustrin och har varit fokus för majoriteten av forskningen inom detta område. Men under de senaste åren har forskning om extraintestinala mikroorganismer ökat kraftigt på grund av deras välkända potential som probiotika. Således studerade vi en stam av Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extraherad från fermenterande kakao. Först undersökte vi effekten av pH på tillväxten av denna stam och studerade dess överlevnad under förhållanden som liknar de i det mänskliga mag-tarmkanalen. L. fermentum TCUESC01 visade resistens mot tillstånd som efterliknade människans mage och tarmar och växte bra mellan pH 5 och pH 7. Därefter utsatte vi L. fermentum TCUESC01 för lagring vid 4 kcal C i en mjölklösning och fann att den överlevde bra i 28 dagar. Slutligen mätte vi känsligheten av denna stam till många antibiotika och dess tendens att autoaggregera. L. fermentum TCUESC01 visade signifikant autoaggregation, liksom mottaglighet för majoriteten av testade antibiotika. Sammantaget stöder våra resultat den potentiella användningen av denna extraintestinala bakterie som ett dietprobiotikum.

1. Inledning

sökandet efter nya probiotika motiveras av kunskapen om att varje stam av mikroorganismer har olika egenskaper och kan ha unika effekter på människors hälsa. Historiskt trodde man att mjölkbakterierna i probiotiska produkter måste hämtas från människor på grund av värdens specificitet . Men extraintestinala mikroorganismer isolerade från fermenterade laktoshaltiga livsmedel eller fermenterade grönsaker uppvisar också lovande probiotiska effekter . Preliminära bevis från vårt laboratorium indikerar att Lactobacillus-stammar härrörande från jäsning av högkvalitativ kakao uppvisar probiotiska egenskaper: de minskar histologisk skada, minskar den systemiska koncentrationen av inflammatoriska cytokiner och ökar serumets iga-nivåer i en in vivo experimentell modell av kolit . Den möjliga användningen av dessa stammar i kommersiella produkter beror dock på en serie tester som rekommenderas av internationella organisationer. Enligt FN: s livsmedels-och jordbruksorganisation (FAO) och Världshälsoorganisationen (WHO) bör potentiella probiotiska stammar utvärderas för deras funktionella och tekniska egenskaper, inklusive deras resistens under gastrointestinal transitering och deras stabilitet under lagring . Därför utvärderade vi de funktionella egenskaperna och säkerheten hos Lactobacillus fermentum-stammen TCUESC01 som isolerades under jäsning av högkvalitativ kakao.

2. Material och metoder

2.1. Mikroorganismer och tillväxtbetingelser

Lactobacillus fermentum TCUESC01 stam (anslutningsnummer KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) odlades i lactobacilli MRS buljong (1% pepton, 0,8% kött extrakt, 0,4% jästextrakt, 2% glykos, 0,5% natriumacetat, 0,2% dikaliumvätefosfat, 0,02% magnesiumsulfat heptahydrat, 0.005% mangansulfattetrahydrat, och 0,02% citronsyra triammoniumsalt) (HIMEDIA 6UC, Indien) för 18 h vid 37 cu c och lagras vid -80 cu c i en 10% mjölklösning (Molico 6UC, Brasilien) innehållande 30% glycerol.

2.2. Analys av tillväxt och livskraft under varierat pH

fru buljonglösningar av pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 och pH 9 framställdes genom tillsats av 1 mol·L−1 saltsyra eller 1 mol·L−1 natriumhydroxid. Före försöket odlades L. fermentum TCUESC01 i 18 timmar och späddes sedan i en saltlösning (0.85% natriumklorid) till en optisk densitet (OD) på 0,3 mätt vid 600 nm (OD600 = 0,3). Försöken utfördes i 96-brunnsmikroplattor (costar GHz), varvid 180 kg fru vid varje pH inokulerades med 20 kg aktiv kultur eller saltlösning som kontroll. Mikroplattan inkuberades vid 37 2CB C och OD vid 600 nm bestämdes timme för 10 h med användning av en spektrofotometer (molekylära enheter 2CB, Versamax tunable microplate reader). Parallellt togs prover varje timme från varje pH, pläterades på MRS-agar och inkuberades under anaeroba förhållanden vid 37 kub C för att testa cellens livskraft.

2.3. In Vitro-tolerans mot gastrointestinala tillstånd

bakterier odlades vid 37 kcal C över natten i 40 mL MRS-buljong, tvättades i en saltlösning och inokulerades i 20 mL av en 10% mjölklösning. Mjölkfermentering fick fortsätta tills ett pH på 4,5 uppnåddes, vid vilken tidpunkt bakterierna räknades (CFU·mL−1) genom seriell utspädning och plätering på MRS agar. Dessutom gjordes en seriell utspädning i en saltlösning (pH 2,5) med pepsin (3 g/L), följt av inkubation vid 37 C i 1,5 timmar. Bakterier tvättades genom två centrifugeringscykler (5000 kcal g/10 min) och resuspension i en saltlösning, innan de återsuspenderades i 20 mL 1% svingalla vid pH 8,0 (Merck GHz, Tyskland) och inkuberades vid 37 kg C i 45 minuter. Bakterieantalet (CFU·mL−1) bestämdes genom plätering av bakterielösningen i MRS-agar under anaeroba betingelser vid 37 kcal C under 48 timmar efter varje inkubationsfas.

2.4. Överlevnad under kylförvaring i surgjord mjölk

L. fermentum-stammen tcuesc01 odlades i MRS-buljong och skördades sedan genom centrifugering (5000 kcal g/10 min). Bakterierna tvättades sedan genom resuspension i en saltlösning och pelleterades igen genom centrifugering. Kulturerna inokulerades i en steril lösning av 10% icke-fet mjölk som hade surgjorts till pH 4,5 med mjölksyra (Synth Kazaki, Brasilien). Mjölklösningen kyldes vid 4 kg C och de kolonibildande enheterna (CFU·mL−1) räknades genom seriell utspädning och plätering på MRS agar vid 0, 7, 14, 21 och 28 dagar. Stamens livskraft bestämdes i förhållande till nollpunkten, som ansågs ha 100% överlevnad.

2.5. Analys av Autoaggregation

L. fermentum TCUESC01 odlades i 20 mL Mrs-buljong över natten vid 37 kcal C. bakteriepelleten uppsamlades och återsuspenderades i saltlösning till en OD av 0,3 Vid 600 nm (OD600 = 0,3). Kapaciteten hos L. fermentum tcuesc01 för autoaggregation testades genom att inkubera suspensionen i vid 37 C och OD övervakades timme för 5 h. den procentuella aggregeringen () beräknades enligt följande: Var är den initiala optiska densiteten vid nolltidpunkten och är den optiska densiteten vid mätningstidpunkten. De visade resultaten var medelvärdena plus / minus standardavvikelserna från tre experiment.

2.6. Antibiotikakänslighetstestning

L. fermentum TCUESC01 odlades för 18 h i MRS-buljong vid 37 kcal C och späddes till 0,5 på McFarland-skalan i en saltlösning. Antibiotikaskivor placerades på Mueller-Hinton-agarplattor som sedan inokulerades med 100 occyl av den aktiva bakteriesuspensionen. Plattorna inkuberades sedan under anaeroba betingelser för 24 h vid 37 kcal C. Inhiberingszonerna runt skivorna mättes och bakterierna klassificerades som resistenta (), måttligt mottaglighet (MS) eller mottagliga () baserat på de standarder som beskrivs i Tabell 1. Antibiotika skivor som används i resistensbestämning var amoxicillin (AMO, LABORCLIN®, Brasilien, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, LABORCLIN, Brasilien, 5 µg), amikacin enligt (AMI, CECON®, Brasilien, 30 µg), azitromycin (AZI, CECON, Brasilien, 15 µg), amoxicillin och klavulansyra (AMC, SENSIFAR®, Brasilien, 30 µg), norfloxacin (ELLER, LABORCLIN, Brasilien, 10 µg), sulfonamid (SUL, NEWPROV®, Brasilien, 300 µg), vankomycin (VAN, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), streptomycin (EST, LABORCLIN, Brasilien, 10 µg), erytromycin (ERI, CECON, Brasilien, 15 µg), tetracyklin (TET, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasilien, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasilien, 30 µg), gentamicin (GEN, CECON, Brasilien, 10 µg), cefotaxime (CTX, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), cotrimoxazole (trimetoprim och sulfametoxazol) (SUT, SENSIFAR, Brasilien, 25 µg), kloramfenikol (BLODPROPPAR, SENSIFAR, Brasilien, 30 µg), klindamycin (CLI, CECON, Brasilien, 2 µg), penicillin G (PEN10, CECON, Brasilien, 10 µg), och cefoxitin (CFO, LABORCLIN, Brasilien, 30 µg).

2.7. Statistiska analyser

beräkningarna av medel och standardavvikelser, variansanalyser, Tukeys multipla jämförelsetester och alla statistiska analyser gjordes med hjälp av GraphPad Ukrainian Prism 5.0-programmet. Alla grafer producerades också med hjälp av GraphPad Prism 5.0-programmet.

3. Resultat

3.1. Effekt av pH på L. fermentum TCUESC01 tillväxt och livskraft

L. fermentum TCUESC01 kunde växa i media vid pH 5, pH 6 och pH 7 (Figur 1). Tillväxt observerades emellertid inte utanför detta pH-intervall (Figur 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(i)

(f)

(sv)

(h)

(och)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figur 1

tillväxt av Lactobacillus fermentum TCUESC01 under perioden från 0 till 10 timmar av kulturer vid 37 kub C i olika pH: (a) tillväxt i fru utan modifiering av pH (pH 6,52); (b) tillväxt i fru med pH 2; (c) tillväxt i fru med pH 3; (d) tillväxt i fru med pH 4; (e) tillväxt i fru med pH 5; (f) tillväxt i fru med pH 6; g) tillväxt i fru med pH 7, h) tillväxt i fru med pH 8, i) tillväxt i fru med pH 9. Varje punkt i grafiken representerar genomsnittet och standardavvikelsen från tre experiment.

3.2. Tolerans för L. fermentum tcuesc01 till gastrointestinala tillstånd In Vitro

toleransen för L. fermentum TCUESC01 till gastrointestinal passage utvärderades under betingelser utformade för att efterlikna det mänskliga mag-tarmkanalen (Figur 2). En bakterielösning odlades till en koncentration av 8,7 msk 108 CFU·mL−1 i en 10% mjölklösning. Efter att ha skickat bakterierna till en lösning innehållande pepsin vid pH 2,5 för 1,5 h för att simulera magsaft, observerade vi en statistiskt signifikant minskning () av bakteriekoncentrationen till 1,23 108 cfu·mL−1. Efter att ha tvättats med saltlösning utsattes bakterierna sedan för en lösning av 1% svingalla vid pH 8, 0 i 45 minuter för att simulera tarmmiljön. Efter denna behandling observerade vi en minskning med cirka 1 logg i bakterieantalet (3,6 msk 107 CFU·mL−1). Minskningen av bakterieantal under inkubation i simulerad tarmsaft var inte statistiskt obetydlig.

Figur 2

överlevnad av Lactobacillus fermentum TCUESC01 under passage genom den simulerade mag-tarmkanalen. ”Fermenterad mjölk ”efter jäsning av mjölken;” simulerad magsaft ”efter passage i saltlösning pH 2,5 + pepsin;” simulerad tarmsaft ” efter passage i oxgalla 1%. Varje punkt i diagrammet representerar genomsnittet och standardavvikelsen för tre experiment. Statistiskt signifikant reduktion () i förhållande till ”fermenterad mjölk.”

3.3. Överlevnad av L. fermentum tcuesc01 under kommersiella lagringsbetingelser

för att utvärdera deras överlevnad under lagring kyldes L. fermentum-bakterier vid 4 kcal C i 28 dagar i en annars steril 10% fettfri mjölk surgjord till pH 4,5 med mjölksyra (Figur 3). Bakteriestammen var initialt i en koncentration av 3,6 109 109 cfu·mL−1, men efter 7 dagars lagring observerade vi en statistiskt signifikant minskning av cirka 1 logg i bakterieantalet. Från dag 7 till dag 21 var det oväntad tillväxt från 4,3 108 108 cfu·mL−1 till 9,0 108 108 CFU·mL−1. Vid dag 28 hade bakteriekoncentrationen minskat till 2,83 kcal 108 CFU·mL−1.

Figur 3

överlevnad av Lactobacillus fermentum TCUESC01 i fermenterad mjölk från 0 till 28 dagar, vid 4 kcal C. varje punkt representerar genomsnittet och standardavvikelsen för tre experiment. ”a”: statistiskt signifikant skillnad i förhållande till dag noll (); ”b”: statistiskt signifikant skillnad i förhållande till dag 14;”c”: statistiskt signifikant skillnad i förhållande till dag 21.

3.4. Autoaggregation av L. fermentum tcuesc01

bakterierna aggregerades alltmer fram till den femte timmen av in vitro-odling, vid vilken tidpunkt maximalt 70,19 1,78% aggregering observerades (Figur 4). Timförhöjningarna i procentaggregationen var emellertid endast statistiskt signifikanta fram till experimentets tredje timme ().

Figur 4

procentandel av Autoaggregation av Lactobacillus fermentum TCUESC01 utvärderad från 1: A till 5: e timmen av odling i MRS-buljong vid 37 kcal C. ”a”: statistiskt signifikant skillnad i förhållande till 1: A timmen av aggregering;” b”: statistiskt signifikant skillnad i förhållande till 2: a timmen av aggregering, . Varje punkt representerar genomsnittet och standardavvikelsen för 3 experiment.

3.5. Känslighet av L. fermentum TCUESC01 till antibiotika

denna stam av L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 var mottagligt för amoxicillin, amoxicillin och klavulansyra, penicillin G, den bacill-laktamer cefotaxim och cefalotin, den aminoglykosider amikacin och gentamycin, den lincosamid klindamycin, den karbapenem imipenem, den makrolider azitromycin och erytromycin, den fenikol kloramfenikol, och tetracyklin. Stammen var också måttligt mottaglig för streptomycin.

4. Diskussion

riktlinjer som fastställts av FAO och WHO bekräftar behovet av att analysera de funktionella egenskaperna och säkerheten hos bakterier innan de föreslår användning i en matmatris . Vi utvärderade initialt kapaciteten hos denna art av Lactobacillus att växa och överleva vid olika pH, och även om den endast uppvisade tillväxt i intervallet från pH 5 till pH 7, förblev den livskraftig under 10-h-inkubationer vid alla utvärderade pH-nivåer, med undantag för pH 2. Studier har visat stor variation i gastrisk pH när magen är tom , med medelvärden lägre än pH 4 . Tarmmiljön är stabilare och varierar mellan pH 6 och pH 8, beroende på den utvärderade tarmregionen . Därför, även om denna mjölksyrabakterie inte har visat förmågan att multiplicera eller överleva under pH 2.5, förblir den livskraftig i tarm pH-området och kan därför fungera i den miljön. I överensstämmelse med våra data visade Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ och ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) och Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) isolerade från en vanligt konsumerad fermenterad dryck (Boza) från Balkanhalvön goda tillväxthastigheter under 10 h inkubation mellan pH 5 och pH 7 . L plantarum 423 isolerad från sorghumdryck, L. plantarum 241 isolerad från gris ileum, L. curvatus DF38 isolerad från salami och Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 isolerad från humana vaginala sekret visade också tillväxt mellan pH 5 och pH 6.5 i liknande experiment . Sammantaget visar våra resultat att L. fermentum TCUESC01 har tillväxt och pH-resistens som liknar andra potentiella extraintestinala probiotiska bakterier. Vidare kan känsligheten hos stammen till pH-nivåer lägre än 2, 5 övervinnas genom användning av metoder som skyddar bakterierna, såsom mikroinkapsling . Våra resultat stöder den potentiella tillämpningen av denna stam som ett probiotiskt tillsatsmedel i livsmedel med tydligt sura egenskaper, till exempel ostar, juice och fermenterad mjölk.

mag-tarmmiljön kan vara fientlig för många bakterier; en mängd olika stressorer som surhet, matsmältningsenzymer och gallsalter kan påverka deras överlevnad negativt under transitering till tarmen . Lactobacillus i denna studie visade en diskret kvantitativ reduktion men förblev livskraftig under mag-och tarmförhållanden och motstod en gallkoncentration tre gånger som hittades i människans tarm (0,3%) . Liknar våra data, Kaushik et al. observerade att Lactobacillus plantarum Lp9 minskade med cirka 0,5 log från sin ursprungliga koncentration när den utsattes för tillstånd som efterliknar magen (pH 2) och 1 log när de utsattes för tillstånd som efterliknar tarmen. I en annan studie, L. rhamnosus VT1 / 1 isolerad från ost visade en minskning med cirka 2 log-koncentration under låga pH-förhållanden (pH 3) och en minskning med 1 log-koncentration när den inkuberades vid pH 7 i närvaro av 2% gallsalter . Våra resultat tyder på att L. fermentum kan röra sig genom mag−tarmsystemet och överleva i koncentrationer över 107 CFU·g−1 (eller CFU·mL-1), vilket tidigare studier tyder på skulle vara tillräckligt för att interagera och/eller störa värdmiljön .

matmatrisen är också en påverkande faktor för mikroorganismernas livskraft under lagring . Vid testning av den långsiktiga överlevnaden av L. fermentum tcuesc01 i surgjord mjölk observerade vi en initial minskning av bakterieantalet följt av en liten ökning från dag 7 till dag 21. Denna tillväxt kan förklaras av fortsatt bakteriell metabolism i mjölklösningen, även om den är reducerad på grund av låg temperatur. Donkor et al. också observerad kvantitativ variation i probiotiska bakterier under lagring vid 4 kg c, särskilt Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 som uppvisade tillväxt av 1 logg från dag 7 till dag 14 av kylförvaring. I en annan studie, L. plantarum lagrad i fermenterad mjölk minskade signifikant sin cellulära koncentration med 1 logg under cirka 28 dagars lagring vid 4 kcal C . Även om L. fermentum hade uppvisat en minskning med 1 logg från dess initiala koncentration vid den sista lagringsdagen, var dess koncentration över genomsnittet vid utgångsdatumet för mjölklösningen . På samma sätt, baserat på rekommendationerna från National Agency for Sanitary Monitoring (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 kan införas i matmatriser som liknar fermenterad mjölk och överleva i tillräckliga koncentrationer fram till produktens utgångsdatum .

mikroorganismer med förmåga att autoaggregera förblir i tarmarna under en längre tid och har därmed bättre interaktioner med epitelceller och värdimmunsystemet . L. fermentum tcuesc01-stammen visade en förhöjd kapacitet för autoaggregation i vår 5-h-studie. Detta resultat är högre än det som rapporterats av Beganovi Bisexual et al. , som visade att L. fermentum A8 hade 60,9 3.91% autoaggregation efter 5 h inkubation, eller som rapporterats av Bao et al. , who visade autoaggregation på mindre än 28% för 10 stammar av L. fermentum efter en 20-timmars inkubation. Baserat på våra resultat, L. fermentum aggregat väl och om intas skulle sannolikt kunna kvarstå i den mänskliga tarmmiljön under långa tidsperioder.

slutligen utvärderade vi mottagligheten av TCUESC01 för en mängd olika antibiotika. Kunskap om antibiotikaresistens är oerhört viktigt när vi överväger tre viktiga faktorer: den sällsynta risken för infektion med Lactobacillus, risken för horisontell överföring av resistensgener till inhemska mikrober och sambandet mellan probiotiska bakterier och antibiotikabehandling. L. fermentum TCUESC01 uppvisade känslighet för majoriteten av antibiotika, med undantag av nukleinsyrasynteshämmare (norfloxacin, ciprofloxacin, sulfonamid och cotrimoxazol) och två cellväggssynteshämmare (vankomycin och cefoxin). Dessa resultat bekräftar data publicerade av Kirtzalidou et al. på 74 stammar av Lactobacillus ssp. isolerad från mänsklig avföring, varav 94.5% stammar var resistenta mot amikacin, alla var resistenta mot kanamycin och ciprofloxacin, 84,7% av stammarna var resistenta mot vankomycin, 1,6% stammar var resistenta mot cefalotin och 8,5% av stammarna var resistenta mot bacitracin. I allmänhet visar laktobaciller inneboende resistens mot kinoloner, trimetoprim, sulfonamider, vankomycin och majoriteten av nukleinsyrahämmare, samtidigt som de visar mottaglighet för proteinsynteshämmare med undantag för aminoglykosider . Det är värt att notera att resistensen mot antibiotika som observeras här är inneboende för släktet, vilket framgår av publicerade studier, och horisontell genöverföring är därför ovanlig. Sammanfattningsvis stöder resistensprofilen För L. fermentum TCUESC01 möjligheten att använda tillsammans med antibiotika som fungerar genom att hämma nukleinsyrasyntes.

5. Slutsatser

trots att det är en extraintestinal stam isolerad under kakaofermentering, visar L. fermentum TCUESC01 stark potential som ett probiotikum för applicering i livsmedelsprodukter. Det förblir livskraftigt över ett brett pH-spektrum och är därför lämpligt för inkludering i olika typer av livsmedel. När den förvaras i en kyld mjölkprodukt upprätthåller den lönsamheten över de nivåer som rekommenderas av erkända nationella och internationella organisationer fram till produktens utgångsdatum. Under förhållanden som efterliknar gastrointestinal transitering överlever den också i kvantiteter som är tillräckliga för att upprätthålla probiotisk potential. När det gäller dess förutspådda beteenden i tarmarna visar L. fermentum TCUESC01 en stark tendens att autoaggregera. Slutligen uppvisar denna stam antibiotikakänslighet och resistensprofiler som möjliggör dess användning tillsammans med läkemedelsbehandlingar. Sammantaget tyder dessa egenskaper på att L. fermentum TCUESC01 har stor potential som ett säkert probiotiskt livsmedelstillsats.

intressekonflikter

författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

erkännanden

denna forskning stöddes av ett bidrag från Funda Bisexo de Amparo a pesquisa do Estado da Bahia (fapesb). Den Conselho de Desenvolvimento cient Portugalifico e Tecnol Portugalico (CNPq) och Coordinaau de Aperfei Portugalioamento De personnels de niveau superior (capes) som produktivitet och examen stipendier för vissa författare.