totalt RNA extraherades med användning av Tripure Isolation Reagent (Roche).
RNA-prover behandlades med RNAs-fri DNaseI och renades med användning av RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Det resulterande RNA utarmades av ribosomalt RNA genom användning av Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) (epicentrum). Det rRNA-utarmade RNA användes för att syntetisera den första strängen cDNA med användning av SuperScript 26-Strängssyntessystem (Invitrogen) enligt tillverkarens instruktioner. Därefter genererades den andra strängen genom användning av E. coli DNA-ligas( Invitrogen), E. coli-DNA-polymeras (Invitrogen) och dUTP, dCTP, dATP och dGTP-uppsättning (10 kcal vardera, Promega), i den andra Strängbufferten (Invitrogen). Sedan klipptes cDNA med Covaris till ungefär 300bp. Efter fragmentering renades proverna med Minelutkolumner (Qiagen). Och de utskjutande 3′ och 5 ’ ändarna av fragmenten reparerades med användning av T4-DNA-polymeras (NEB) och T4-DNA-Polynukleotidkinas (NEB) i T4-DNA-ligasbuffert (NEB). Därefter genererades dA-ändar genom att använda Klenow-Fragment (3′ ->5’ exo -, NEB), i buffert 2 (NEB). Adapterligeringsreaktioner ställdes sedan in med indexerade adaptrar och snabb ligas (NEB). Produkterna användes som mall för UNG (Fermentas) behandling och PCR-amplifiering med användning av Phusion High-Fidelity DNA-polymeras (NEB). Biblioteken visualiserades på 2% e-Gel, allmänna agarosgeler (Invitrogen). De streckkodade biblioteken sekvenserades på en enda körfält av en HiSeq2500 (Illumina).
