High Fidelity & effektivt PCR-enzym: KOD DNA-polymeras
den hypertermofila archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (tidigare Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) isolerades från en solfatarisk varm källa (Fig. 2) på Kodakara island (Fig. 3) i Japan, och identifierades och karakteriserades.
en familj B – DNA-polymeras (KOD-DNA-polymeras) hittades i denna kod1-stam och visar olika unika egenskaper (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (Kodakara island, Japan)
-
Fig. 3. Restauranger i närheten av Kodakara island (Kagoshima prefecture, Japan)
KOD – DNA-polymeras uppvisar stark exonukleasaktivitet på 3 ’- 5 ’ (korrekturläsningsaktivitet), en aktivitet som Taq-DNA-polymeras saknar.
dessutom uppvisar detta enzym utmärkt processivitet och förlängningsförmåga, vilket visar en femfaldig högre förlängningshastighet (100-130 nukleotider/sekund) och 10-15-faldig högre processivitet (>300 baser) än den från Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-polymeras). Förlängningshastigheten för detta enzym är ungefär 2 gånger högre än för Taq DNA-polymeras (Tabell 1)(Fig. 4) (1).
Tabell 1. Egenskaper hos termostabila DNA-polymeraser
| Proterty | värde för indikerat DNA-polymeras | ||
|---|---|---|---|
| KOD-DNA-polymeras | PFU-DNA-polymeras | Taq-DNA-polymeras | |
| Ursprung | Archaea | Archaea | bakterier |
| härledd molekylmassa (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optimal temperatur (OC) | 75 | 75 | 75 |
| optimalt pH vid 75 | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termostabilitet (halveringstid) | 95 Baccarat, 12 timmar; 100 oc,3,0 h | 95 Baccarat, 6 timmar; 100 Baccarat, 2,9 h | 95 Baccarat, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Jämförelse av förlängningshastigheter för KOD Pfu och Taq DNA-polymeras.
förlängningshastigheten mättes i enlighet med längden av syntetiserat DNA, med användning av M13 ssDNA som mall vid 75 OCCBC.
parallellt med studien av aktiviteterna för KOD-DNA-polymeras utvecklades neutraliseringsantikroppar för polymeraset och korrekturläsningsaktiviteterna (2). Dessa antikroppar kan appliceras på” hot start PCR-tekniken ” med hjälp av KOD-DNA-polymeras.
3-D-strukturen för DNA-polymeras karakteriserades 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. 3-D-struktur av KOD-DNA-polymeras
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus- (kod nr. KOD-201) utvecklades baserat på KOD DNA-polymeras och uppvisar hög PCR-trohet (Tabell2).
Tabell 2. Jämförelse av mutationsfrekvensen för varje PCR-enzym.
| totala baser sekvenserade | antal muterade baser | Mutationsfrekvens (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNA-polymeras | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq – bas lång-PCR enzym | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA-polymeras | 102,708 | 145 | 141.2 |
Fidelity mättes som mutationsfrekvensen genom sekvensering av PCR-produkten. Efter kloning av PCR-produkten (2,4 kb i den humana beta-globinregionen) valdes och sekvenserades cirka 96 kloner.
KOD FX (kod nr. KFX-101) utvecklades baserat på KOD-DNA-polymeras och visar en mycket större PCR – framgångsgrad (baserat på effektivitet och förlängningsförmåga) än KOD-Plus – (kod nr. KOD-201) eller andra Taq-baserade PCR-enzymer. KOD FX är också effektivt för förstärkning från råa prover (t.ex. mus svans lysat, odlade celler).
Fig. 6. Direkt förstärkning från en rå mus svans lysat
1,2: KOD FX
3~6: andra företagets enzymer
M: markörer
