jämförande analys av Knockout-serumet med fetalt bovint Serum för in Vitro-Långtidsodling av humana Limbala epitelceller

Abstrakt

de limbala epitelcellerna kan bibehållas på 3T3-matarskikt med fetalt bovint serum kompletterat odlingsmedium, och dessa celler har använts för att framgångsrikt behandla limbal stamcellsbrist. Fetalt bovint serum innehåller emellertid okända komponenter och visar kvantitativa och kvalitativa parti-till-Parti-variationer. För att förbättra odlingstillståndet undersöktes det definierade KnockOut – serumutbytet för att ersätta fetalt bovint serum för odling av human limbal epitelcell. Humana primära limbala epitelceller odlades i KnockOut serum och fetalt bovint serum kompletterat medium, respektive. Celltillväxthastigheten, genuttrycket och underhållet av limbala epitelstamceller studerades och jämfördes mellan dessa två grupper. Humana primära limbala epitelceller isolerades och framgångsrikt seriellt odlas i denna nya KnockOut serum kompletterat medium; cellproliferationen och stamcellsunderhållet liknade de hos celler som odlades i fetalt bovint serum kompletterat medium. Dessa data tyder på att detta KnockOut-serum kompletterat medium är en effektiv ersättning för traditionellt fetalt bovint serum kompletterat medium för limbal epitelcellodling, och detta medium har stor potential för långsiktigt underhåll av limbala epitelceller, limbal epitelstamcellstransplantation och vävnadsregenerering.

1. Inledning

Hornhinnepitelstamceller finns i Limbus basalskikt, en korrugerad och pigmenterad struktur som kallas Palisaderna av Vogt . Dessa stamceller upprätthåller kontinuerlig förnyelse av hornhinnepitelet under en livstid och ersätter skadade eller förlorade hornhinnepitelceller . Limbal stamcellbrist (LSCD) och associerade okulära ytsjukdomar kan behandlas framgångsrikt med odlad limbal epitelial autograft . Framgången för dessa kirurgiska behandlingar beror på effektiv expansion av limbala epitelstamceller som involverade 3T3 matarskikt och fetalt bovint serum (FBS) i de flesta fall. 3T3-matarlagerkultursystemet inrättades av Rheinwald och Green och har framgångsrikt använts för att expandera epitelceller från mänsklig hud, hårsäck, limbus, konjunktiva och oral slemhinnevävnad . FBS är dock inte väldefinierad, och det visar alltid kvantitativa och kvalitativa lot-to-lot-variationer . FBS innehåller också potentiellt skadliga xenogena komponenter, som kan stimulera immunologiska reaktioner och överföra djursjukdomar och patogener . Med alla dessa bekymmer finns det ett ökande behov av att utveckla väldefinierat kulturmedium för att ersätta det traditionella FBS-kompletterade mediet.

för närvarande finns det vissa serumfria alternativa medier för tillväxt av epitelceller, såsom definierat keratinocyt-serumfritt Medium (KSFM, Invitrogen, USA), keratinocyttillväxtmedium (KGM, Clontech, USA), Epilife (Invitrogen, USA) och Progenitor Cell Targeted (PCT) media (CellnTEC, Schweiz). Dessa produkter har visat sig stödja expansionen av hornhinnepitelceller. Men de behöver fortfarande tillskott av odefinierade produkter, såsom bovin hypofysextrakt (BPE) eller humant serumalbumin (HAS). Och de flesta av dessa medier kräver hög cellsådddensitet, vilket kanske inte är praktiskt för expansion av humana hornhinnepitelceller. Dessutom kunde hornhinnepitelstamceller, som detekteras som holokloner i 3T3-odlingssystemet, inte upprätthållas i detta serumfria odlingsmedium på lång sikt . Hittills finns det inget definierat serumfritt medium som kan stödja expansion av hornhinnepitelstamceller på lång sikt.

KnockOut serum replacement (SR) är en definierad serumfri formulering, som var utformad för att direkt ersätta FBS för underhåll av embryonala stamceller (Esc) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Det har visats att KnockOut SR ger konsekventa tillväxtförhållanden för ES-cell-och iPSC-odling, och ES-celler som odlas i KnockOut SR-kompletterat medium är väsentligt mindre differentierade än de som odlas i FBS-kompletterat medium, och överföring av könsceller äventyras inte minst. Med tanke på likheterna i odlingsmetoderna för epitelceller och ES-celler, och mot bakgrund av det faktum att KnockOut SR ersätter FBS i ES-cellodling, antas det här att KnockOut SR kan användas för att ersätta FBS i limbal epitelcellodling.

2. Material och reagenser

cellodlingsrätter, kolvar, centrifugrör och serologiska pipetter köptes från Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbeccos modifierade Örnmedium( DMEM), Ham ’ s F-12, HEPES, penicillin och streptomycin, L-glutamin, 0,05% trypsin-0.02% EDTA-lösning, Superscript III-kit och rneasy-satser för att ta fram rneasy-produkter förvärvades från Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Fetalt bovint serum (FBS) köptes från Hyklon (Logan, ut; http://www.hyclone.com/). Mus NIH 3T3 fibroblaster (ATCC CCL 92) erhölls från amerikansk Typkultursamling (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II var från Roche. Monoklonal antikropp (mAb) mot ABCG2 (klon BXP-21) och connexin 43 var från Millipore; p63 (klon 4A4), K5 och K19 kom från Santa Cruz; K3 mAb (klon AE5) var från ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-konjugerad get anti-mus sekundär antikropp var från Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR och Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase UNG kit var från Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycin C, bovint insulin, humant transferrin, hydrokortison, human epidermal tillväxtfaktor (EGF), koleratoxin och andra reagens var från Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Human Limbal Epithelial cellisolering och odling

Cornea-limbal ringar skördades från fem friska givare strax efter hornhinnetransplantation, informerat samtycke söktes och provskördningsprotokollet godkändes av Institutional Review Board (IRB) av Jilin University. Färska hornhinna-limbala ringar behandlades med 0,25% Dispase II vid 4 kg C över natten, och epitelskiktet skrubbades från den underliggande stromavävnaden och behandlades med 0,05% trypsin-0,02% EDTA vid 37 kg C i 15 minuter. Trypsinaktivitet neutraliserades med 10% FBS och dissocierade limbala epitelceller uppsamlades och centrifugerades vid 1500 rpm i 5 minuter. Epitelcellens livskraft bestämdes av trypanblått exklusive färgning och cellnummer räknades med hjälp av hemocytometer.

mus 3T3 fibroblaster bibehölls i Dulbeccos modifierade Örns Medium (DMEM, hög glukos) kompletterat med 10% FBS, L-glutamin (2 mM) och penicillin-streptomycin (50 IE/mL) och odlades med 5% CO2 och fuktad atmosfär. 3T3-celler subkulturerades var 6: e dag när de nådde 80-90% sammanflöde. 3T3-celler upprätthölls seriellt, och endast celler före passage 20 användes för beredning av matarskikt. För att förbereda matarskiktet behandlades sammanflytande 3T3-celler med mitomycin C (10 kg/mL) i 2 timmar vid 37 kg C, tvättades med PBS två gånger och behandlades med 0,05% trypsin i 5 minuter vid 37 kg C. 3T3 fibroblaster uppsamlades sedan och pläterades med en densitet av 30 000 celler/cm2 en dag före sådd av epitelceller.

humana limbala epitelceller odlades på 3T3-matarskikt med användning av antingen FAD medium eller serum replacement (SR) medium. FAD-mediet är en blandning av DMEM och Ham ’ s F-12-medium (1 : 1) innehållande 10% fetalt bovint serum, L-glutamin (2 mM) och penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal tillväxtfaktor (10 ng/mL), insulin (5 kg/mL), adenin (0,18 mM), hydrokortison (0,4 kg/mL), koleratoxin (0,1 nM) och triiodotyronin (2 nM). SR-mediet är en blandning av DMEM och Ham ’ S F-12-medium (1 : 1) innehållande 10% KnockOut SR-serumersättning, L-glutamin (2 mM) och penicillin-streptomycin (50 IE/mL), epidermal tillväxtfaktor (10 ng/mL), insulin (5 kg/mL), adenin (0,18 mM), hydrokortison (0.4 kg / mL), koleratoxin (0,1 nM), trijodtyronin (2 nM), transferrin (5 kg/mL) och selen (5 ng/mL). Limbala epitelceller såddes på 3T3 matarskikt med en densitet av 6000 celler / cm2 och odlades med 5% CO2 och fuktad atmosfär. FAD-mediet byttes var 3: e dag medan SR-mediet byttes var 2: e dag.

2.2. Kolonibildande effektivitetsanalys (CFE)

för CFE-analys pläterades 200 humana limbala epitelceller från FAD-kultur eller SR-kultur på 100 mm petriskål innehållande mitomycin C-behandlat 3T3-matarskikt och odlades enligt beskrivningen ovan. Efter 12-dagars kultur fixades disken med 10% formalin i 30 minuter vid rumstemperatur och färgades med 1% Rhodamin B i ytterligare 30 minuter. Efter tvättning med destillerat vatten räknades koloninumren och analyserades. Kolonibildningseffektiviteten uttrycktes som antalet bildade kolonier dividerat med 200.

2.3. Cellpopulation Fördubblingsanalys

Limbala epitelceller bibehölls på mitomycin C-behandlat 3T3-matarskikt med FAD-medium eller SR-medium. Epitelceller trypsiniserades när de nådde 80-90% sammanflöde och passerade vid en densitet av 6000 celler/cm2. Kulturer upprätthölls seriellt för 10 passager. Vid varje passage skördades limbala epitelceller och cellnummer räknades. Antalet befolkningsdubblingar (PD) för varje passage beräknades enligt följande formel: , där representerar det totala antalet celler som erhållits vid varje passage och representerar antalet pläteringsceller i början.

2.4. RNA-extraktion och kvantitativ Realtidspolymeraskedjereaktion

för att utvärdera genuttrycksnivån för limbala epitelceller utfördes PCR och realtids-PCR. Totalt RNA extraherades från hornhinnans epitelceller med användning av RNeasy-satsen enligt tillverkarens instruktioner. RNA kvantifierades genom dess absorption vid 260 nm och lagrades vid -80 kcal C. För att syntetisera cDNA användes 1 usci totalt RNA med Superscript III omvänd Transkriptionssats. PCR utfördes med användning av Platinum PCR master mix (Life Technology); och realtids-PCR utfördes med användning av SYBR Green PCR Master Mix (Roche) med de primers som beskrivits tidigare . Realtids PCR-reaktioner utfördes i tre exemplar med ett initialt aktiveringssteg vid 95 CCB i 3 minuter, följt av 45 cykler: 95 CCB i 30 sekunder, 60 CCB i 30 sekunder och 72 CCB i 40 sekunder. Relativ genuttryck beräknades genom normalisering av skillnaden i cykeltröskelvärde (delta Ct), värden av generna till delta Ct-värdet av glyceraldehyder-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH).

2.5. Immunofluorescerande färgning

humana limbala epitelceller såddes i odlingsglas med 3T3-matarskikt i FAD-medium eller SR-medium. Tre dagar efter sådd fixades kulturerna med 4% paraformaldehyd eller kall aceton vid 4 msk C i 10 minuter. Efter tvättning med PBS två gånger blockerades celler med 5% getserum i PBS i 30 minuter. De primära musantikropparna mot p63 (1 : 200, 4a4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) och connexin 43 (1: 1000, Millipore) applicerades och inkuberades över natten vid 4 msk C. Alexa Fluor 568-konjugerad sekundär antikropp applicerades i 1 timme efter tvättning med PBS två gånger. Cellkärnorna motsatsades sedan med Hoechst 33342 (1 kg/mL i PBS) i 20 minuter. Efter tvättning med PBS i 3 gånger monterades cellkulturen med monteringsmedium (Vektorlaboratorier, Burlingame, CA) och undersöktes under ett fluorescerande mikroskop (BX50; Olympus, Tokyo, Japan).

2.6. Western Blot-analys

odlade limbala epitelceller lyserades med RIPA-buffert (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% natriumdeoxikolat, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA och proteashämmare cocktail; Roche Diagnostics) på IS i 30 minuter. Proteinkoncentrationen kvantifierades med användning av bicinchoninic acid (BCA) proteinanalys (Pierce, Rockford, IL). Totala celllysater (40 occurg) elektroforesades i 12% gradient SDS-PAGE gel, överfördes till nitrocellulosamembran (Bio-Rad), blockerades med 5% skummjölk i Tris-buffrad saltlösning (TBS) i 1 timme och probed med musantikroppar mot prolifererande cellkärnantigen (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) eller p63 (4A4, Santa Cruz, CA) över natten vid 4 oc C. membranen tvättades sedan tre gånger med TBS, inkuberad med get anti-mus IGG (1 : 5000, HRP-konjugerad, Santa Cruz, CA) eller kanin anti-get IGG (1 : 5000, HRP-konjugerad, Santa Cruz, CA) i 1 timme vid rumstemperatur och utvecklad med förbättrade kemiluminescerande substrat (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Uttrycksnivåerna för ABCG2, PCNA och p63 mättes med semikvantitativ intensitetsmätning och normaliserades till GAPDH-nivå som fungerade som intern kontroll.

2.7. Statistik

sammanfattning av data för CFE och relativ vikning av realtids-PCR rapporterades som medel för sackarios SD och jämfördes med studentens oparade test med Microsoft Excel (2003/XP-version). Testresultat rapporterades som två-tailed värden, där ansågs statistiskt signifikant.

3. Resultat

3.1. Fenotypen av Hornhinnepitelstamceller i SR-Medium

totalt 5 hornhinna-limbala ringvävnader skördades från givare i åldersintervallet 32-65 år. Dessa vävnader bevarades och bearbetades inom 24 timmar efter skörden. Mänsklig primär hornhinnepitelcellodling sattes framgångsrikt upp i FAD-medium(figurerna 1(A) och 1 (b)) och SR-medium(figurerna 1(c) och 1 (d)) också. De hornhinnepitelceller som upprätthölls i SR medium + 3T3 matarskikt visade en morfologi med liten storlek och höga kärnor/cytoplasmförhållande, vilket var typisk odifferentierad epitelcellsmorfologi, och de stora differentierande platta skivepitelliknande cellerna observerades sällan (Figur 1(c)). Epitelcellerna som upprätthölls i SR-medium började bilda kolonier 3 dagar efter sådd (Figur 1(c)). Storleken på dessa kolonier liknade de som bildades inom FAD medium + 3T3 matarskikt (Figur 1(A)), men dessa kolonier var mindre tätt komprimerade än de i FAD + 3T3 matarskikt. Inom 7 dagar nådde epitelceller sammanflöde i SR-medium med enhetlig liten storlek (Figur 1(d)), vilket också observerades i FAD-kultur (Figur 1(b)). I denna studie kunde humana hornhinnepitelceller härledas och bibehållas i SR medium + 3T3 matarskikt för alla fem givare. För långvarig odling subkultiverades humana hornhinnepitelceller seriellt i SR medium + 3T3 matarskikt i mer än 10 passager (). Under varje passage trypsiniserades celler och uppsamlades när celler nådde 80-90% sammanflöde; cellnummer beräknades för populationsdubblingsanalys. Resultatet visar att epitelcellsutbytet från SR-medium är nära det för celler odlade i FAD-medium, som visas i Figur 2(a), och dessa data liknar tidigare rapporter . Sammanfattningsvis visar de data som presenteras här att SR-odlingsmedium + mitomycin C-behandlat 3T3-matarskikt stöder mänskliga hornhinnepitelceller klonal tillväxt och proliferation.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 1

kulturen av humana limbala epitelceller i SR-medium. (a) de mänskliga hornhinnepitelcellerna bildade tätt komprimerade kolonier i modefluga medium efter sådd celler i 3 dagar. (b) efter 7 dagar nådde epitelceller sammanflöde i modefluga medium med enhetlig liten storlek. (C) mänskliga hornhinnepitelceller bildade kolonier inom SR-medium, som liknade de som bildades inom FAD-medium, men dessa kolonier var mindre tätt komprimerade än de i FAD. (d) efter 7 dagar nådde epitelceller sammanflöde i SR-medium med enhetlig liten storlek som liknade dem i FAD-kulturens ursprungliga förstoring: (a) 10, (b) 10 10 (skalstänger: 100 1.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 2

jämförelse av cellpopulation fördubbling (PD) och kolonibildande effektivitet (CFE) av humana limbala epitelceller odlade i SR och FAD media. (a) humana limbala epitelceller subkulturerades seriellt i SR-medium och FAD-medium för 10-passager (); cellpopulation doublings (PD) – nummer och ackumulerad PD beräknades och plottades. PD beräknades enligt följande formel:, där representerar det totala antalet celler som erhållits vid varje passage och representerar antalet pläteringsceller i början av varje passage. (b) för att analysera CFE såddes limbala epitelceller med en densitet av 200 celler per 100 mm petriskål i SR-och FAD-media och fick växa i 12 dagar. (c) CFE-värden för epitelceller i SR-och FAD-media var respektive. Inga skillnader i CFE hittades mellan SR medium och FAD medium group (,). (D) procentandelen koloniserat område i FAD var nära det för SR-medium. De limbala epitelcellerna som upprätthölls i SR-medium uppvisade liknande CFE-och kolonistorlek jämfört med celler som upprätthölls i FAD-medium.

3.2. CFE-analys

därefter undersökte och jämförde vi CFE av hornhinnepitelceller odlade i FAD och SR media. För att analysera CFE skördades hornhinnepitelceller odlade i SR-och FAD-media och såddes med en densitet av 200 celler per 100 mm petriskål, som förinställdes med mitomycin C-behandlat 3T3-matarskikt, och denna kultur fick växa i 12 dagar. Hornhinnans epitelceller började bilda kolonier 5-7 dagar efter odlingsinitiering. Som visas i Figur 2(b), efter odling i 12 dagar, uppvisade hornhinnans epitelceller som upprätthölls i SR-medium liknande CFE och kolonistorlek jämfört med celler som upprätthölls i FAD-medium. CFE-värde för epitelceller i SR och FAD media var respektive (figur 2(c)). Statistisk analys visade att det inte fanns några signifikanta skillnader i kolonibildningseffektivitet () och den genomsnittliga ytan av kolonierna () mellan SR och FAD media (Figur 2(c)). Vi kvantifierade procentandelen av kolonityperna baserat på koloniernas område. Resultaten visade att andelen abortiva kolonier (koloniområde <1 mm2) bildade i SR-medium liknade det inom FAD-medium (). På samma sätt var andelen stora kolonier (koloniområde >4 mm2) som bildades i SR-medium nära det i FAD-medium () (Figur 2(d)). Dessa resultat indikerar att hornhinnepitelceller odlade i SR-medium har en liknande högre grad av proliferativ potential jämfört med celler odlade i FAD-medium.

3.3. PCR-och realtids-PCR-analys

för att studera genuttrycket utfördes PCR och realtids-PCR på epitelceller odlade i både FAD-och SR-media. Hushållning gen GAPDH användes som en intern kontroll. PCR-data visar att cellen som odlas i både FAD-medium och SR-medium visar transkripturuttryck på hög nivå av proliferativ markör PCNA. Cellerna i båda medierna visar positivt uttryck av cytokeratin 3 och cytokeratin 12, vilket överensstämmer med deras limbus-ursprung. Det positiva uttrycket av basalskiktets epitelcellsmarkör, cytokeratin 15, observerades också i båda kulturerna. ABCG2-och Aucli Np63-expression detekterades i båda kulturerna, även om ABCG2-expression minskade något efter primärkultur i SR-medium. Den låga nivån av connexin 43-uttryck observerades i båda kulturerna och innebar låg nivå av epitelcelldifferentiering i båda medierna. För realtids-PCR visade kvantitativ analys av mRNA-nivån att det inte fanns någon signifikant uttrycksskillnad () av p63 och ABCG2 mellan epitelceller odlade i FAD-och SR-media (Figur 4(A)). Realtidsanalys av hornhinnans epiteldifferentieringsmarkör cytokeratin 3 och cytokeratin 12 utfördes också. Båda dessa två markörer var knappt detekterbara i både FAD-och SR-cellkulturer, och överraskande finns det ingen signifikant skillnad () i uttrycksnivå mellan dessa två kulturer.

3.4. Immunofluorescerande färgning

för att bekräfta att epitelcellerna odlade i SR-medium upprätthöll stammen och odifferentierat tillstånd utfördes immunofluorescerande färgning av flera proliferation, differentiering och förmodade epitelstamcellsmarkörer. Som visas i Figur 4, i SR-medium, visade de flesta epitelceller en liten och enhetlig morfologi, och de flesta celler färgades starkt med p63, den förmodade epitelstamcellsmarkören. ABCG2-positiva färgade celler observerades också i en fläckig fördelning inom de limbala epitelcellkolonierna. Cellerna som upprätthölls i SR-medium färgades svagt för connexin 43 och cytokeratin 3. Det låga uttrycket av dessa två differentieringsmarkörer antyder låg nivå av epitelceller differentiering i cellkulturen. Den liknande färgningsstilen observerades också i celler som upprätthölls med FAD-medium (Figur 4(b)). Dessa data antyder att humana limbala epitelceller odlade i SR-medium upprätthöll högnivåuttryck av förmodade epitelstamcellsmarkörer, samtidigt som de uttryckte låg nivå av differentieringsmarkörer.

3.5. Western Blot

för att dubbla bekräfta det kvantitativa genuttrycket och immunofluorescerande färgningsresultat utvärderades uttrycket av potentiella epitelstamcellsmarkörer (p63 och ABCG2) och proliferationsmarkör (PCNA) med western blot. Med användning av monoklonal p63-antikropp (klon 4A4, Santa Cruz) detekterades p63-proteinet (70 KD, oc-Nic-isoform) vid hög expressionsnivå i SR-medium. Uttrycket av ABCG2 (70 KD) detekterades i varje passage av celler odlade i SR-medium. PCNA, proliferationsmarkör, detekterades också i celler odlade i SR-medium (Figur 3(c)). Och uttrycksnivåerna för p63, ABCG2 och PCNA var liknande i 10 passager med semikvantitativ intensitetsmätning (Figur 3(d)) med GAPDH som intern kontroll.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 3

genuttryck och proteinuttryck i humana limbala epitelceller. (a) genuttrycksanalys av humana limbala epitelceller. PCR-data visar att cellerna odlade i både FAD-medium och SR-medium visar högnivåuttryck av proliferationstranskript PCNA i P1, P4, P7 och P10. Cellerna i båda medierna visar positivt uttryck av cytokeratin 3 och cytokeratin 12, vilket innebär deras limbus-ursprung. Det positiva uttrycket av basalskiktets epitelcellsmarkör, cytokeratin 15, observerades också i båda kulturerna. ABCG2-och Exceptionalnp63-uttryck detekterades i båda kulturerna; deras uttryck observerades minskas något efter passage 7 (P7) i båda kulturmedierna. Den låga nivån av connexin 43 (Cx43) uttryck observerades i båda kulturerna och innebar låg nivå av epitelcelldifferentiering i båda medierna. (b) kvantitativ realtids-PCR-analys av humana limbala epitelceller odlade i SR och FAD media. Realtids-PCR utfördes på epitelceller odlade med både FAD-och SR-media. Hushållning gen GAPDH användes som en intern kontroll. Analys av de limbala epiteliala stamcellsmarkörerna p63 och ABCG2 mRNA fann att det inte fanns någon signifikant skillnad (, ) i uttryck mellan epitelceller odlade i FAD-och SR-media. Realtidsanalys av hornhinnans epiteldifferentieringsmarkör cytokeratin 3 och connexin 43 utfördes. Alla dessa markörer var knappt detekterbara i både FAD-och SR-cellkulturer, och överraskande finns det ingen signifikant skillnad (, ) av uttrycksnivå mellan dessa två kulturer. Alla PCR-experiment i realtid utfördes i tre exemplar. (C) Western blot-analys av humana limbala epitelceller odlade i FAD-och SR-medier. Uttrycket av proliferationsmarkör (PCNA) och potentiella epitelstamcellsmarkörer (p63 och ABCG2) utvärderades med användning av western blot. Med användning av monoklonal antikropp klon 4A4 detekterades p63-proteinet (70 KD) vid hög expressionsnivå i SR-medium. Uttrycket av ABCG2 detekterades i varje passage av celler odlade i SR-medium. PCNA, cellkärnantigenet, en cellproliferationsmarkör, detekterades också i epitelceller odlade i SR-medium. (d) uttrycket av ABCG2, p63 och PCNA kvantifierades och plottades med semikvantitativ intensitetsmätning. Blotdensiteten för ABCG2, p63 och PCNA mättes och normaliserades till nivån av GAPDH.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

uttryck av epitelstamcellstillverkare och differentieringsmarkörer i humana limbala epitelceller. De mänskliga limbala epitelcellerna färgades starkt med ABCG2 och p63 (grön) i SR och FAD media. Cellerna som upprätthölls i SR-och FAD-media visade svag färgning för connexin 43 (Cx43) och cytokeratin 3 (K3). (a) SR medium och (b) FAD medium. Ursprunglig förstoring: a) 10. B) 10. 10. 100.100. Studierna genomfördes i tre exemplar och representativa siffror visas här.

4. Diskussion

epitelceller odlade på 3T3 matarskikt har framgångsrikt härletts och använts för behandling av olika kliniska situationer, såsom svåra brännskador, diabetiska fotsår, hudfel och orala slemhinnedefekter . Den första transplantationen av limbala epitelstamceller beskrevs 1997 av Pellegrini et al. . Under de senaste decennierna har flera olika odlingsmetoder utvecklats, inklusive odling av limbala epitelceller på humant amniotiskt membran (HAM) med eller utan 3T3-matarskikt , odling av epitelceller på temperaturkänsliga plattor och odling av epitelceller med kommersiellt serumfritt odlingsmedium. Som ny rapport indikerar att det kliniska resultatet av hornhinna/limbus epitelceller transplantation beror på om de limbala stamcellerna bevaras i cellkulturen, påpekades att holoclones endast behölls i FAD + 3T3 kultursystem . Eftersom detta kulturprotokoll innebär att man använder FBS, finns det växande säkerhetsproblem att FBS är dåligt definierade animaliska produkter och har potential att överföra djurhärledda sjukdomar till patienter . Därför finns det ett ökande behov av att utveckla djurproduktfritt och FBS-fritt odlingsmedium för att ersätta traditionellt MODEFLUGMEDIUM .

i denna studie utvecklade vi ett nytt serumfritt odlingsmedium, där KnockOut SR ersatte FBS. Fenotyperna av limbala epitelstamceller i detta nya serumfria odlingsmedium utvärderades genom immunfärgning med antikroppar för föreslagna stamcellsmarkörer (p63, ABCG2) och differentieringsmarkörer (cytokeratin 3, connexin 43).

den nukleära transkriptfaktorn p63 föreslogs tidigare att vara en markör för epitelstamceller, och Auctoris är den dominerande isoformen av p63-isoformer i dessa celler . Våra resultat överensstämmer med dessa tidigare rapporter; nukleär p63 uttrycktes starkt i limbal cellkultur, vilket visades genom immunfärgning, realtids-PCR och western blot. Närvaron av p63 i limbal cellkultur indikerar deras höga proliferativa och självförnyelsepotential. ABCG2, en medlem av ATP-bindande kassett (ABC) transportörer, ursprungligen känd som bröstcancerresistent protein 1 (BCRP1), har föreslagits som en annan förmodad stamcellsmarkör för vuxna stamceller, inklusive limbus epitelstamceller . Det höga uttrycket av ABCG2 i SR-mediet bevisades genom immunfärgning och realtids-PCR.

K3 och K12 är välkända som kornealspecifika markörer . Konsekvent visade våra immunfärgning och realtids-PCR-resultat att cellerna var K3 och K12 negativa, vilket bekräftade deras limbus-ursprung. Connexin 43 är medlem i gap junction-proteinfamiljen; det möjliggör direkt diffusion av lösta ämnen med låg molekylvikt mellan angränsande celler. Connexin 43 rapporterades uttryckas av differentierade epitelceller, och frånvaron av dessa intercellulära kommunikationsmolekyler kan vara en egenskap hos epitelstamceller.

i våra resultat uttryckte en större andel celler p63 och ABCG2, medan få celler uttrycker differentieringsmarkörer K3/K12 och CX43. Således visade humana limbala epitelstamceller i SR-serumfritt medium liknande fenotyper och upprätthåller odifferentierade tillstånd jämfört med FBS-medium.

Sammanfattningsvis, med KnockOut SR som ersätter FBS, upprätthåller vårt nya serumfria medium tillväxt och proliferation av humana hornhinnepitelceller och behåller epitelstamceller i deras odifferentierade fenotyp. Denna nya serumfria odlingsmetod är tilläggsdefinierad och relativt lätt att kontrollera. Det har stor potential att användas vid klinisk limbal epitelcellstransplantation och vävnadsregenerering.

konkurrerande intressen

författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

bekräftelser

detta arbete stöddes av bidrag från Jilin University och National Natural Science Foundation of China (NSFC 30500548).