2.3.4.1 strukturen
apo-sCTLA-4-homodimeren uttrycktes som ett trombin-klyvbart Fc-fusionsprotein i CHO-celler i närvaro av kifunensin.23 Efter deglykosylering gav homodimeren kristaller som diffrakterade till Bragg-avstånd på 1,8 kg, med enhetscelldimensioner på a = 43,86 kg, b = 51,46 kg och c = 102,85 kg och rymdgruppen P212121 (Ref. 130). Strukturen löstes genom molekylär ersättning. Den asymmetriska enheten bestod av en disulfidbunden homodimer som möjliggjorde jämförelser med sCTLA-4/sB7-1 och sCTLA-4/sB7-2-komplexen och med sCTLA-4 bunden till ett konstruerat lipokalin.131
de två monomererna i den asymmetriska enheten bestod av domänerna för smörgåsar med agfcc’ och Abed topologi som förväntat av Metzler et al.132 en kort åtta-Rest ”stjälk” disulfidbunden vid Cys122 kopplade IgSF-domänerna till membranet. Oväntat var de två halvorna av apo-CTLA-4-homodimeren mindre lika varandra än deras komplexa motsvarigheter, och betonade att bindning inte åtföljs av storskaliga strukturella omarrangemang (Fig. 2.2 H). Automatiserade strukturjämförelser identifierade CD28 och PD-1 som de strukturer som mest liknar CTLA-4. Viktiga skillnader mellan CTLA-4 och CD28 var: i) förekomsten av en kink i C28-sträng g, ii) förändringar i slingstorlek, inklusive förlängda AB -, BC-och CC-slingor i CTLA-4 och en stympad C”D-slinga, och iii) h-Bindning av C’ och C” – strängar i C’ C” till följd av ompositionering av C ’ C ” – slingan i CD28. Av central betydelse var den i stort sett identiska konformationen av FG-slingan 99MYPPPY104-sekvensen som bildade kärnan i deras ligandbindande ytor. Endast en enda vattenmolekyl kunde hittas i den ovanligt torra ligandbindande ytan av apo-CTLA-4, medan 228 vatten detekterades någon annanstans.
efter CD28 och PD-1 var de näst mest likartade strukturerna till CTLA-4 V-set-domänen 215 antikropps-eller TCR V-domäner, som huvudsakligen skiljer sig åt endast i slinglängder. RMS-skillnaden för överlagring av CTLA – 4 med den mest likartade TCR Va-domänen var 2,09 kcal för 102 rester, i kontrast till 2,89 kcal för 86 rester för överlagring med D1 CD2. Viktiga delade funktioner med VA-domänen inkluderade den långa CC-slingan och konserverade sackarios-utbuktningar i C’-och g-strängarna för att påföra en uttalad twist på agfcc’ – arket. Särskilt anmärkningsvärt var den höga graden av sekvensbevarande och Ca-konformation nära G-strängen AA-utbuktning, det vill säga GNGTQIYV (CTLA-4) och GDGTQLVV (Va). I CD2 och CTLA-4 var slingorna lika, och domänerna skilde sig i den mån som: (jag) i CD2 det var ingen H-limning av ßA och ßB delar, (ii) det var ingen vridning av EN’GFCC ”β-ark i CD2 på grund av flyttning av β-utbuktningar, (iii) position C” β-strand i CD2 men inte CTLA-4 tillåtna canonical H-bindning och förlängning av AGFCC ”C” β-ark, och (iv) CTLA-4 saknade twist i FG-slinga finns i CD2 (och även, till exempel, B7-1). Analysen av femtiotvå V-set igsf-domäner med användning av ett sekventiellt strukturanpassningsprogram133 indikerade att CD28/CTLA-4-familjen innefattar en undergrupp av V-set-domäner som skiljer sig från grupperna av CD8, antigenreceptorer och ”adhesion” – molekyler, till exempel B7-1 och CD2. Sammantaget var det större likhet mellan CD28 / CTLA-4-undergruppen till antigenreceptorfamiljen jämfört med vidhäftningssatsen. Analysen föreslog att CD28 / CTLA-4-familjeproteiner och antigenreceptorer delade en gemensam förfader som möjligen liknade PD-1, med de två familjerna som divergerade tidigt.
Apo-CTLA-4 bestod av en homodimer med dess underenheter som antog ett arrangemang som gynnar ortogonala bivalenta interaktioner med ligander placerade på apposerande cellytor. Jämförelser med CTLA-4-monomerparen i B7-1-och B7-2-komplexen106,107 och monomeren i lipokalinkomplexet131 avslöjade mycket begränsad rotationsflexibilitet vid homodimergränssnittet och anmärkningsvärt få, om några, förändringar hänförliga till ligandbindning. De enda skillnaderna var uppenbara i B7-2-komplexet, med liten ompositionering av BC-och CC-slingorna, och av C” – strängen och angränsande slingor, och konformationsskillnader i G-strängen vid dess C-terminal. Dessa lokala variationer var avlägsna från ligandbindningsstället för CTLA-4 och för inget fall skilde sig apo-monomererna systematiskt från alla fem komplexa CTLA-4-monomerer. Huvudkedjans atompositioner i 99mypppy104-sekvensen var väsentligen identiska.
strukturerna för komplexen bildade av CTLA-4 Med B7-1 och B7-2, som inte tidigare hade jämförts, var ganska olika.130 Substitution i B7-2, av Val28 vs Arg29 i B7-1, bildade en bindningsficka i B7-2 som endast delvis fylldes av CTLA-4. Detta säkerställde att B7-1/CTLA-4-komplexet uppvisade bättre formkomplementaritet än B7-2 / CTLA-4-komplexet. Kompenserar något för detta var ytan begravd i B7-2 av CTLA-4 något större än för B7-1. Sammantaget bundet B7-1 CTLA-4 på ett ännu styvare kroppsliknande sätt än CTLA-4 engagerade B7-1. B7-2-bindning av CTLA-4 var dock mer komplex och bar kännetecknet för ”inducerad passform.”I CTLA – 4 bound-vs apo-B7–2, Det var en 2,3-3,5 kg förskjutning av B7-2 FG slingan mot CTLA-4, som initierades av en ~ 120 grader rotation av Phe31 av B7-2 (Ref. 130). Detta gav en staplingsinteraktion av Phe31 med Pro102 av 99mypppy104-sekvensen av CTLA-4.
