Kluyveromyces marxianus utvecklar etanoltolerans under adaptiv utveckling med signifikanta förbättringar av multipla vägar

förbättrad resistens mot etanol efter en 100-dagars utveckling

den vilda typen haploid K. marxianus-stammen odlades i medium med 6% (v/v) etanol vid 30 kcal C i 100 dagar om 450 generationer (se metoder för detaljer). Det var en kontinuerlig ökning av biomassa (mätt med OD600 dagligen) under denna period (Fig. 1a), vilket indikerar cellöverlevnad under etanolspänning kan förbättras. I slutet fick vi en K. marxianus-befolkning med kraftigt förbättrad resistens mot etanol (Fig. 1b). Under hela tiden hänvisar KM till den råa stammen före evolutionen, och KM-100d hänvisar till K. marxianus-befolkningen efter 100-dagars utveckling. Den maximala etanolmotståndet för KM var 7% (v / v) och för KM-100d var det upp till 10% (Fig. 1b). Vi jämförde tillväxtprofiler mellan KM och KM-100d i kulturmedier med olika etanolnivåer (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, Fig. 1c). I frånvaro av etanol var det ingen signifikant skillnad mellan stammarna. Deras skillnad ökade med ökningen av etanolnivån och nådde maximalt med 6% (v/v) etanol i odlingsmedier. Under sådana omständigheter, efter 48 h, var biomassan av KM-100d nästan dubbelt högre än KM. Båda stammarna visade fördröjd tillväxt i medium med 7% etanol och misslyckades med att växa i mediet med 8% etanol. Dessutom visade KM-100d också anmärkningsvärd högre maximal tillväxttakt än KM vid 6% etanol (ytterligare fil 1: figur S1).

K. marxianus evolution i 6% (v/v) etanol. ett dagligt OD600-värde av K. marxianus-befolkningen under evolutionen. Celler överfördes varje dag och subkultiverades till ett nytt medium innehållande 6% (v/v) etanol, med samma initiala OD600 av 0.6. Därefter mättes OD600 för att registrera celltillväxt efter inkubation vid 30 kcal C i en orbital shaker i 24 timmar. B fläckig utspädningsanalys för etanoltolerans mellan före och efter evolution. KM och KM-100D-celler inokulerades på flytande medium med etanol vid en av gradientkoncentrationerna: 0, 1, 2,…, 11% (v / v), respektive, och inkuberades vid 30 kcal C i 3 dagar. En cellsuspension av 10 OD600 från det flytande mediet späddes 5-faldigt seriellt och upptäcktes på en YPD-platta och odlades vid 30 kcal C i 2 dagar. C Tillväxtprofiler av KM Och KM-100D vid olika etanolkoncentrationer. Den röda kurvan är För KM-100d, och den svarta är För KM. Under tillväxtprofilmätning utfördes både KM och KM-100D i biologisk triplikat

DNA-analys tyder på att K. marxianus inte har någon förändring av ploidy eller kritiska gener under adaptiv utveckling

för att belysa DNA-förändringar i KM-100d, genomförde vi DNA-ploidy-analys och DNA-mutationsidentifiering. Under den adaptiva utvecklingen har DNA-innehållet i K. marxianus-befolkningen liten förändring (Ytterligare fil 1: figur S2); således skedde ingen ploidy-förändring. Genom DNA – SEQ-analys av KM och KM-100d, som båda kartlades till referensgenomet av K. marxianus DMKU 3-1042 , erhölls SNP-platserna mellan KM och KM-100d (ytterligare Fil 2). Bland de identifierade 57 SNP: erna var endast 4 platser dominerande I KM-100d-befolkningen. Tre av dem är belägna i kodningsområdet SAN1 -, YAP1-och KHT2-gener; den andra är vid 445 bp uppströms ERG26. 1324-platsen för SAN1 muterades från C till T, och följaktligen transformerades motsvarande aminosyra från arginin till cystein. Men enligt analys av Pfam 32.0, faller denna mutation inte i någon identifierad proteindomän. Både mutationerna i YAP1 och KHT2 är synonyma mutationer utan proteinförändring. Ovanstående fynd tyder på att förändringar i DNA-sammanhang är långt ifrån tillräckliga för att stödja sådan fenotypförbättring I KM-100d, och transkriptionell omprogrammering måste bidra till detta. Därför genomförde vi vidare RNA-seq-analys.

en global omkoppling inducerad av 100-dagars evolution

för att grundligt förstå etanoltoleransen utförde vi en RNA-seq-analys för att jämföra genuttryck av KM Och KM-100d-jäst som växte i media med 4% och 6% (v/v) etanol. Baserat på tillväxtprofilerna (Fig. 1C) observerades att tillväxtförmågan mellan KM-100d och KM hade den maximala skillnaden vid 48 h; Därför samlades prover vid 48 h för RNA-seq-analys. Inställning / log2ratio / 0 1 och p värde < 0.05 som kriterium för att definiera signifikanta differentiellt uttryckta (de) gener utförde vi de-genidentifiering i sju grupper (Fig. 2, betecknad som 1, 2, 3, 4, 5, 6, och 7 respektive). I varje grupp utfördes de-analys enligt pilen som pekade på kontrollen. Ytterligare fil 3 ger uttrycksvärden och differentialuttrycksstatistik för alla gener. Det finns en global uttrycksskillnad mellan KM och KM-100d när båda växte i ett etanolfritt medium (Fig. 2 Grupp①). KM – 100d-jäst har 1342 gener med högre uttryck än KM-jäst, medan endast 188 gener har lägre uttryck. I media med 4% och 6% (v/v) etanol reduceras antalet uppreglerade gener i KM-100d kraftigt till 415 (grupp②) respektive 453 (grupp③). De uppreglerade gennumren är emellertid fortfarande mycket mer än de med lägre uttryck (104 respektive 182 gener). Dessa resultat tyder på att KM-100d-jäst transkriberas genom att aktivera ett stort antal gener. Förslaget stöddes ytterligare av de etanolinducerade uttrycksförändringarna inom KM-och KM-100d-jästarna. Under induktion av 4% och 6% (v/v) etanol har KM-jästarna 1452 och 1465 uppreglerade gener (grupper XIII och xnumx) medan KM-100d-jästarna endast har 631 respektive 596 uppreglerade gener (grupper ④ respektive xnumx). Dessutom tillämpade vi värmekarta.2 programvara i r-paket till klustergener och grupper baserade på log2ratio-värden (ytterligare fil 1: figur S3) och fann att gendifferentialuttrycksprofilen i Grupp ① ligger nära den för grupp Alf. Tillsammans behöll KM-100d-jästarna många etanolinducerade uttrycksfunktioner även om de växte i ett etanolfritt medium. Funktionerna gör att den utvecklade cellen är mer anpassningsbar till kommande etanolstimulering, dvs KM-100d-jäst behöver inte aktivera så många gener som KM gör.

Global analys av RNA-seq-data i KM och KM – 100d under etanolspänning. I denna figur delade vi RNA-seq-data för gendifferentialuttrycksanalys. KM och KM-100D presenterades i respektive vänstra och högra delar och etanolkoncentrationer 0%, 4% och 6% (v/v) var belägna i rader. RNA – seq-data delades in i sju grupper, betecknade som①,②,③,④,④, xylitoch inte. I varje grupp pekar en pil på kontrollen för differentialuttrycksidentifiering, och de röda siffrorna betecknar det uppreglerade gennumret, medan de gröna representerar det nedreglerade numret

därefter utförde vi i varje grupp gen ontologi (GO) anrikningsanalys för de gener (ytterligare fil 1: Figur S4) och fann att de berikade Go-termerna täckte ett brett spektrum av cellulära grundläggande fysiologiska processer, inklusive ribosombiogenes, aminosyrabiosyntes, DNA-reparation, RNA-bearbetning etc., men inte direkt relevant för etanolresistens. Därför fokuserade vi i det följande särskilt på vägar som är starkt associerade med etanolmetabolism och tolerans genom att analysera de associerade de-generna (ytterligare fil 4).

KM – 100d förbättrad etanolanvändning

för att underlätta grafillustrationen delades log2ratio-värdena för involverade de-gener (ytterligare fil 4) in i fem intervaller: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (och ovan), som visas i Fig. 3.

möjliga etanolförbrukningsvägar i K. marxianus. I denna figur konsumeras etanol både i cytoplasman (övre delen) och mitokondrier (nedre delen). Blågrå rektangel betecknar den involverade genen, och grupperna①,②,③,④,③, xylitoch är i linje med dessa definitioner i Fig. 2. Rött och grönt i gruppnummer betecknar genens upp-respektive nedreglering. Färgens intensitet representerar graden av genuttrycksförändring, korrespondensen mellan färg och log2ratio-värde kvantifieras av färgfältet i figurens övre vänstra hörn

skillnaden mellan KM och KM – 100d i etanolförbrukning undersöktes. Som illustreras i Fig. 3, två vägar kan existera för direkt konsumtion av etanol, och var båda uppreglerade I KM och KM-100d när de mötte etanol (grupper④, xhaml, xylitoch Xiaomi). Ett sätt är via cytoplasmatisk ADH6, som katalyserar etanol till acetaldehyd, underlättat av NADP+. Den andra är av mitokondriell ATF1, som främjar etanolförestring med hjälp av acetyl-CoA. Speciellt, i KM-100d under etanolspänning (grupper ④ och④), var YGL039W uppreglerad för att generera mer NADP+ och kan därmed leverera fler koenzymer för omvandling av etanol till acetaldehyd för att minska etanoltoxiciteten. I mitokondrier, för KM exponerade i etanolstress (grupper XIII och xnumx), var endast C2E1P301 och ADH4 uppreglerade. Medan I KM-100d, under processen från etanol till aldehyd till acetat, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 och ALD6 var alla uppreglerade (grupp①). De ovan nämnda förändringarna indikerar att KM-100d kan förvärva ny förmåga att lindra etanoltoxicitet genom att öka etanolkonsumtionen. Teorin förklarar att KM – 100d utfördes över KM i medium med etanol.

KM-100d förbättrad membranlipidbiosyntes, Anti-osmotiskt tryck, anti – oxidativ stress och proteinvikning för att motstå etanolspänning

förutom att konsumeras påverkar den ackumulerade etanolen direkt cellmembranintegritet, förändrar inre och yttre osmotiskt tryck, stör proteinkonformation och inducerar reaktiv syreart (ROS) generation, vilket orsakar allvarlig skada på jästcell . I det följande analyserade vi de gener i dessa vägar för anti-etanol-orsakade skador i K. marxianus (Fig. 4).

ett schematiskt diagram för antietanol orsakade skador i K. marxianus. I den vänstra delen av denna figur påför ackumulerad etanol i mediet ett osmotiskt tryck till jästcellen och aktiverar därefter den osmotiska responsiva vägen. I mitten tränger miljöetanol in i cellen och stör cellmembranet. I den högra delen syntetiseras cellmembranlipider för att befästa och reparera det skadade cellmembranet. I den nedre delen stör etanol proteinkonformationen och orsakar oxidativ stress, så de relaterade sensorerna och responsvägarna aktiveras. Gruppnummer och färger för genens differentiella uttryck är i linje med de i Fig. 3

efter etanoldriven utveckling aktiverades alkoholstressresponsvägen I KM-100d. ASR1, som translokerar från cytoplasman till kärnan vid exponering för etanol , och ETP1, som fungerar som ett cytoplasmatiskt retentionsprotein med en roll i etanolberoende transkriptionsaktivering av värmechockproteingener , var båda uppreglerade I KM-100d (grupp①) och delvis uppreglerade I KM-faced etanol (grupper XYZ), vilket tyder på att även i ett etanolfritt medium kan KM-100d förbereda responsiva vägar för etanolutmaning, precis som KM: s svar på etanol.

bildandet av membranlipid spelar en viktig roll för att hålla cellmembranintegriteten under etanolspänning . Omättade fettsyror, de viktigaste komponenterna i cellmembranstrukturen, är nära besläktade med etanoltolerans . Illustrerad i Fig. 4, från acetyl-CoA till omättad fettsyrabiosyntes till införlivande i fosfolipid, var de involverade generna PPT2, FAD2 och TAZ1 alla uppreglerade I KM-100d (grupp①), vilket tyder på att KM-100d efter evolutionen redan kan förbättra omättad fettsyrabiosyntes för att leverera mer råmaterial för cellmembranbiogenes. Och nedregleringen av gener ACC1, TSC13, FAS1 I KM exponerad i etanol (grupper XYZ och ZZ) överensstämmer med den tidigare rapporten, som kan redogöra för K. marxianus svaga etanoltolerans före adaptiv utveckling.

ett stort antal gener associerade med cellmembranlipidbiogenes, inklusive fosfoglycerid, sfingolipid och sterol, uttrycktes differentiellt under etanolspänning (Fig. 4). Speciellt var gener som var involverade i fosfoglyceridbiosyntes i allmänhet uppreglerade I KM-100d (grupp①) och I km-faced etanol (grupper XIII och xnumx), vilket indikerar att fosfoglycerid kan vara huvudkomponenten i cellmembranet för etanolresistens. För sterolbiosyntes, många gener (t.ex., ERG9 och ERG7) nedreglerades i grupper ④ och xylitoch flera gener uppreglerades i Grupp ③ (t. ex., ERG25) och gruppnorm (t. ex., ERG26), vilket tyder på att sterolbiogenes kan vara viktigt för att stå upp till hög etanol, men inte för låg etanol. Dessutom var generna CKI1, ERG2 och ERG25, involverade i fosfoglycerid-och sterolbiosyntes, endast uppreglerade i grupp Xham; detta kan vara en av ledtrådarna för KM-100ds bättre prestanda än KM i hög etanol.

hög etanolkoncentration i ett medium påför osmotisk stress på jästceller . Såsom visas i Fig. 4, plasmamembranets osmotiska sensorer (SLN1, OPY2 och SHO1) och gener (HOG1, SSK1 och SSK2) som var involverade i den nedströms responsiva vägen var alla uppreglerade I KM exponerade i låg etanol (grupp xnumx) och individuellt uppreglerade I KM-100d (Grupp①), I KM-100d inför etanol (grupper ④ och xnumx) och I KM konfronterade hög etanol (grupp xnumx). Glycerolproduktion är ett viktigt sätt för S. cerevisiae att motstå osmotiskt tryck . När KM och KM – 100d mötte etanol var de flesta gener relaterade till glycerolbiogenes nedreglerade. Ovanstående resultat tyder på att före och efter evolutionen, K. marxianus förbättrar alltid vägar för avkänning och transducing osmotiska spänningssignaler; emellertid kan dess strategi för att motstå osmotisk stress inte förlita sig på glycerolproduktionsvägen, det måste finnas några andra sätt.

cellvägg ger tillräcklig mekanisk styrka för att cellen ska motstå osmotiskt tryck , och den sekretoriska vägen transporterar inte bara cellväggproteiner utåt utan överför också lipider till plasmamembran för att befästa membranstrukturen; därför kan dessa två processer vara ansvariga för anti-osmotisk stress. Vi analyserade de gener i sekretorisk väg och cellväggbiogenes (ytterligare fil 1: figur S5). Gener som är involverade i den sekretoriska vägen och cellväggbiogenesen var i allmänhet uppreglerade I KM-100d (grupp①), och några av dem var också uppreglerade I KM exponerade i etanol (grupper XYZ och XZ). Det innebär att KM-100d inte bara upprätthöll uppregleringen i sekretorisk väg för KM som är resistent mot etanolspänning utan också utvidgade aktiveringsomfånget för sekretorisk väg för att förbereda sig för etanolattack; därför kan förbättring av sekretorisk väg och cellväggbildning vara den nya strategin KM-100d utvecklad för att uthärda etanol-orsakad osmotisk stress. Å andra sidan, FÖR KM och KM-100d exponerad i låg etanol (grupper ④ och XIII), var många gener i sekretorisk väg båda nedreglerade, vilket tyder på att sekretorisk vägaktivering kanske inte är det nödvändiga sättet för K. marxianus att svara på låg etanol.

för mot oxidativ stress utlöst av etanol (Fig. 4), HYR1 , som fungerar som en sensor och givare av hydroperoxidspänning, uppreglerades I KM och KM-100d båda exponerade i hög etanol (grupper xhamand etc). Oxidativa stressresponsiva transkriptionsfaktorer SKN7 och STB5 var uppreglerade I KM-100d (grupp①) och I KM mötte hög etanol (grupp alfa). För anti-oxidativ stress var gener som är involverade i superoxiddismutassystemet (t.ex. MTM1 och PRX1) i allmänhet uppreglerade I KM-100d antingen exponerade i etanol eller inte (grupper①, ④ och④). För tioredoxinsystemet, gener (t. ex., MXR1 och TRR1) var uppreglerade I KM och KM-100d båda inför etanol. Tioredoxin och dess reduktas rapporterades också förbättra K. marxianus tolerans mot flera lignocelluloser-härledda hämmare . För glutaredoxinsystemet var generna GRX2 och GLR1 endast uppreglerade I KM-100d exponerade i hög etanol (grupp④). För peroxisombiogenes var gener som PEX6 och PEX7 uppreglerade I KM-100d (grupp①), och några andra gener (t.ex. PEX3 och INP2) nedreglerades I KM och KM-100d när de möttes med låg etanol (grupper ④ och XIII). Ovanstående innebär att KM – 100d globalt kan stärka antioxidantförmågan.

för att säkerställa korrekt proteinvikning under etanolspänning (Fig. 4), var värmechocktranskriptionsfaktorn HSF1 uppreglerad I KM och KM-100d inför låg etanol (grupper ④ och XYZ), ett antal chaperonrelaterade gener (t.ex. PFD1 och CPR7) uppreglerades I km inför etanol (grupper XYZ), höll också upp-reglering I KM-100d (grupp①). Cpr4) nedreglerade I km inför etanol var inte nedreglerade I KM-100d. Därför kan KM-100d generellt förbättra proteinvikning för att ge en mer stabil cellulär miljö.

det rapporterades att i S. cerevisiae var trehalosackumulering viktig för etanoltolerans, på grund av att trehalos fungerade som kompatibelt löst ämne för att förhindra tillströmning av överskott av salter i jästceller ; under tiden inducerades också gener som var involverade i trehalosnedbrytning av etanol för att justera den vid optimal koncentration . För K. marxianus (Fig. 4), fann vi att gener som deltar i trehalos biosyntes och nedbrytning (t. ex., NTH1 och TSL1) var vanligtvis uppreglerade när de behandlades med låg etanol (grupper ④ och XIII), men inte gen uppreglerade i trehalos metabolism när de exponerades i hög etanol (grupper Challenger och number). Detta tyder på att i K. marxianus kan trehalosackumulering vara en speciell strategi för att hantera låg etanol, men inte för hög etanol.

differentiella uttryck för 15 gener involverade i ovanstående etanoltoleranta vägar validerades med RT-qPCR-analys (Fig. 5). Gener uttryck i Grupp ① (Fig. 5a) var i allmänhet uppreglerade. Å andra sidan uppregleringen av gener i Grupp ④ (Fig. 5d) och grupp för grupp (Fig. 5e) var inte lika hög som i grupp XIII (Fig. 5b) och gruppnummer (Fig. 5c). Vår analys bekräftade att gener som bidrar till etanoltolerans kontinuerligt aktiveras i KM-100d även efter uttag av etanolspänning. Det kontinuerliga genuttrycket kan vara till hjälp för att stabilisera den intracellulära miljön och dra nytta av tillväxten av celler i kommande stress.

RT-qPCR-analys för gendifferentialuttryck av KM och KM-100D i olika grupper. en KM-100D vs. KM båda i det etanolfria mediet. Detta är för de genanalys i Grupp①. B KM exponeras i 4% (v/v) etanol kontra KM i ett etanolfritt medium. Detta är för grupp XX. C KM exponeras i 6% (v/v) etanol kontra KM i ett etanolfritt medium. Det här är för gruppen. d KM-100d exponeras i 4% (v/v) etanol vs KM-100D i ett etanolfritt medium. Detta är för grupp④. E KM – 100d exponeras i 6% (v/v) etanol kontra KM-100D i ett etanolfritt medium. Detta är för gruppexilis. I varje prov användes 18S som en intern kontroll. Totalt RNA isolerades från celler odlade vid 48 h i biologiskt triplikat

validering av förbättrad etanolförbrukning och multipel stressmotstånd I KM-100d

Vi kontrollerade tillväxten av KM Och KM-100d-jäst i YNB-medium med olika kolkällor (Fig. 6a). Både KM-och KM-100d-jästarna har samma förmåga att utnyttja glukos som den enda kolkällan. I närvaro av 1% och 2% (v/v) etanol som enda kolkälla växte KM-100d-jäst bättre än KM-jäst. Resultatet stöder vår ovannämnda hypotes att KM-100d-jästarna använde etanol mer effektivt än KM-jästarna gjorde.

celltillväxtanalys på etanol och cellviabilitet och jäsning under flera påfrestningar. en celltillväxtanalys av KM Och KM – 100d baserad på glukos eller etanol som kolkälla. En cellsuspension av 10 OD600 späddes femfaldigt seriellt och upptäcktes på en YNB-platta med glukos eller etanol som den enda kolkällan och odlades i 2 dagar, som illustreras längs kolumner. B-cell livskraft analys av KM Och KM-100D under termisk stress. Temperaturerna är 30 C, 37 C, 40 C och 45 C C. C. cellviabilitetsanalys under oxidativ stress. H2O2 användes som oxidationsstimulans och dess koncentrationer är 0%, 0,04%, 0,06% och 0,08%. d cellviabilitet under osmotiskt tryck. Högt salt (NaCl) användes för att orsaka osmotiskt tryck, med koncentrationer av 0 M, 0,5 m, 0,6 m och 0.7 M. E Etanolutbyte och glukosutnyttjande I KM och KM-100d i den grundläggande omständigheten. f Etanolutbyte och glukosutnyttjande under 45 C. g etanolutbyte och glukosutnyttjande under 6% (v/v) etanolspänning. h Etanolutbyte och glukosutnyttjande under 8% (v/v) etanolspänning. I underfiguren b-d finns KM och KM-100D i respektive första och andra rader. En cellsuspension av 10 OD600 späddes 5 gånger seriellt och upptäcktes på en YPD-platta och odlades i 2 dagar. Med undantag för det termiska testet med specificerade temperaturer utfördes alla andra tester vid 30 kcal C. I subfigure e–h representerar vänster y-axel och höger y-axel glukosrester i mediet (betecknat i svart) respektive etanolproduktion (betecknad i blått)

å andra sidan, baserat på Fig. 4, KM-100d kan utveckla resistens mot etanol-orsakade flera spänningar samtidigt, inklusive osmotisk stress, oxidativ stress och termisk stress (för värmechockproteiner som tas som chaperoner för proteinvikning). För att utvärdera jästens toleranser till flera spänningar genomförde vi cellviabilitetsanalysen för olika temperatur -, oxidations-respektive osmotiska tryck (Fig. 6b-d). I den grundläggande omständigheten (dvs. 30 c c, 0% H2O2 och 0 M NaCl) saknas en skillnad i lönsamhet mellan km och KM-100d jäst. Men i närvaro av de olika spänningarna uppvisar KM-100d-jäst betydligt bättre livskraft än KM-jäst. Vidare är fördelarna mer signifikanta medan spänningarna blev allvarligare (Fig. 6b-d). Vi förväntade oss att toleranserna för flera spänningar skulle kunna introducera nya funktioner för jästarna i etanolproduktion.

Vi undersökte vidare etanolproduktiviteten mellan km och KM-100d-jäst under flera påfrestningar. I grundläggande omständighet (30 kg C och 0% etanol, Fig. 6e) är KM-Och KM-100d-jästarna nästan desamma i både glukosförbrukning och etanolproduktion. KM – 100d-jästarna visade emellertid signifikanta fördelar i närvaro av hög temperatur (45 kcal C, Fig. 6F) eller mer etanol (6% eller 8%, Fig. 6g, h) ; den gemensamma miljön hände vanligtvis i det sena jäsningsstadiet. Vi genomförde en RT-qPCR-analys för både KM och KM-100d jäst jäst i media med 6% etanol vid 48 h, 72 h och 120 h (Fig. 7). De flesta av dessa etanoltoleranta gener uppreglerades I KM-100d jämfört med I KM, särskilt i det tidigare stadiet (48 h) för initial justering till etanol (Fig. 7). För att sammanfatta, genom uppreglerande uttryck av etanoltoleranta gener, överträffade KM-100d-jästarna KM-jästarna under stressiga miljöer med ökade etanolutbyten.

RT-qPCR-analys för genuttryck i KM och KM – 100d under jäsning. en KM-100d vs. KM båda vid 48 h i jäsning. b KM-100D vs. KM båda vid 72 h i jäsning. c KM-100D vs. KM båda vid 120 h i jäsning. I varje prov användes 18S som en intern kontroll. Både KM och KM-100d odlades i media med 6% etanol. Totalt RNA isolerades från celler odlade i biologiskt triplikat